تُعد تقنية الفلوسيتومتري أداة فعالة لتحليل تجمعات الخلايا استنادًا إلى العلامات السطحية والداخلية. ويسمح التلوين داخل الخلايا بالكشف عن مجموعة واسعة من المؤشرات الحيوية الداخلية التي تلعب أدوارًا رئيسية في الوظائف الخلوية والتنظيم المناعي.
من بين هذه المؤشرات التي يمكن تحليلها:
السيتوكينات: مثل IFN-γ، TNF-α، IL-2
عوامل النسخ : مثل FoxP3 وSTATs
جزيئات الإشارة: كالفوسفوبروتينات pERK ، pAkt
البروتينات المرتبطة: بالتكاثر أو الاستماتة مثل Ki-67 وBcl-2
تحفيز الخلايا:
لتحفيز إنتاج السيتوكينات، تُعرَّض الخلايا لمحفزات مثل PMA/ Ionomycin أو مستضدات نوعية.
كما تُستخدم مثبطات نقل البروتين مثل Brefeldin A أو Monensin لمنع إفراز السيتوكينات، مما يسمح بتراكمها داخل الخلية.
تلوين العلامات السطحية:
يُجرى هذا التلوين قبل التثبيت والتخلل لتحديد مجموعات الخلايا (مثل CD4، CD8)، وهو مهم لتوصيف الأنماط المناعية.
تثبيت الخلايا:
يُستخدم الفورمالدهيد أو البارافورمالدهيد (PFA) لتثبيت الخلايا، مما يحافظ على سلامة البنية الخلوية ويمنع تدهور البروتينات.
تخلل الخلايا (Permeabilization) :
تُستخدم محاليل تحتوي على منظفات (مثل السابونين أو Triton X-100) لفتح مسام في الغشاء الخلوي، ما يسمح بدخول الأجسام المضادة إلى الأهداف داخل الخلية.
أما الميثانول فيُستخدم بشكل خاص للوصول إلى الأهداف النووية مثل FoxP3 وKi-67.
التلوين داخل الخلايا:
يتم تحضير الخلايا باستخدام أجسام مضادة موسومة فلوريًا تستهدف الجزيئات الداخلية المطلوبة.
ومن المهم استخدام ضوابط مناسبة مثل FMO (Fluorescence Minus One) لتفسير النتائج بدقة.
علم المناعة: تحليل التعبير عن السيتوكينات في خلايا Th1/Th2/Th17.
أبحاث السرطان: الكشف عن الفوسفوبروتينات المرتبطة بمسارات الإشارة.
بيولوجيا الخلايا الجذعية: دراسة عوامل النسخ الأساسية مثل Oct4 و Nanog.