استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من العينات البيولوجية

استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)

استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) و الحمض النووي (DNA) والبروتين هو تقنية أساسية في علم الأحياء الجزيئي. يمكن فصل هذه البيوماركرات من عينات بيولوجية لأغراض بحثية وتشخيصية وعلاجية مختلفة. يشمل استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) فصل وتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من عينات بيولوجية متنوعة مثل أنسجة الجسم، الخلايا، سوائل الجسم، الدم، وغيرها. تعتبر جودة وكمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص عوامل مهمة للغاية لضمان دقة تحليل تعبير الجينات وغيرها من التطبيقات في مختبرات الأبحاث الجزيئية. يعد وجود إنزيم ريبونوكلياز (Ribonuclease) في الأنسجة والخلايا أكبر عقبة في استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)، لأنه يقوم بتفكيك الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأحادي السلسلة بسرعة.

كيفية إجراء استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)

لا يمكن استخدام طرق استخراج الحمض النووي (DNA) لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)، نظرًا للاختلاف الكبير بينهما من الناحية البنيوية. الحمض النووي الريبوزي (RNA) هو جزيء بيولوجي أحادي السلسلة، بينما الحمض النووي (DNA) ثنائي السلسلة. بالإضافة إلى ذلك، الحمض النووي الريبوزي (RNA) أكثر حساسية للعوامل البيئية مثل درجة الحرارة والريبونوكليازات، لذا يجب إجراء خطوات استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) في ظروف خاصة.

تكون بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من عينات بيولوجية مختلفة متشابهة تقريبًا، ولكن توجد اختلافات طفيفة في البروتوكول بناءً على نوع العينة المستهدفة. على سبيل المثال، يتطلب استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الأنسجة مراحل أكثر مقارنة باستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الرواسب الخلوية، حيث يتطلب الأمر عدة خطوات تحضيرية للعينة النسيجية. مثال آخر على هذه الاختلافات هو استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا العصبية ونسج الدماغ، حيث أن هذا النسيج غني بالدهون، مما يجعل استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الجودة أمرًا صعبًا.

لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الجودة ونسبة نقاء مرتفعة، يجب مراعاة عدة عوامل، تشمل: يجب أن يكون الحمض النووي الريبوزي (RNA) النهائي خاليًا من أي ملوثات، مثل البروتين، الحمض النووي (DNA) الجينومي، أو مثبطات إنزيمات تخليق cالحمض النووي (DNA) والحمض النووي (DNA) بوليميراز، والتي تشمل الفينول، الكلوروفورم، والإيثانول. كما أن غياب النوكلياز في الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص مهم جدًا لمنع تحلل الحمض النووي الريبوزي (RNA). تتأثر تفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وتقنيات جزيئية أخرى بشكل كبير بعمليات استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) ووجود ملوثات مختلفة مثل الهيموغلوبين، الدهون، وأيونات الكالسيوم. لذا، فإن إعداد بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا والأنسجة مهم للحصول على نتائج موثوقة.

أنواع طرق استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)

توجد ثلاث تقنيات أساسية لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)، وهي:

1. طريقة استخراج قائمة على الكلوروفورم- الفينول (Phenol-Guanidine Isothiocyanate (GITC)-based solutions).

2. تقنية استخراج باستخدام عمود دوار قائم على غشاء السيليكا (Silica-membrane based spin column technology).

3. الطريقة الثالثة باستخدام الجزيئات المغناطيسية (Magnetic particle method).

طريقة استخراج قائمة على الكلوروفورم- الفينول:

تعد تقنية استخراج السائل- السائل القائمة على الكلوروفورم- الفينول الطريقة الأكثر شيوعًا لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الأنسجة والخلايا، وهي أساس معظم مجموعات الاستخراج المستخدمة. تحتوي هذه الطريقة على مزايا وعيوب. أكبر عيب لهذه الطريقة هو التلوث بمكونات خلوية ومذيبات أخرى. كما تتطلب هذه الطريقة ظروف وقائية قياسية في المختبر مثل الوصول إلى خزانة كيماوية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) بجودة وكمية عالية، كما يمكن إعدادها بسهولة.

تقنية استخراج باستخدام عمود دوار قائم على غشاء السيليكا:

تحتاج تقنية استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) القائمة على عمود السيليكا إلى مذيبات سامة أقل، وتكون نسبة التلوث بمكونات أخرى في الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص بهذه الطريقة أقل. تحتوي أعمدة الطرد المركزي المستخدمة في تنقية الأحماض النووية على راتنج سيليكا يرتبط بـ الحمض النووي الريبوزي (RNA) تحت درجة حموضة منخفضة، ترتبط جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) بشكل انتقائي بغشاء السيليكا، بينما تمر البروتينات والبوليسكاريدات عبره. ثم يتم إزالة الشوائب عن طريق الغسل، وأخيرًا في ظروف منخفضة الملحية، يتم فصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن الغشاء ويمكن تخزينه.

طريقة استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام الجزيئات المغناطيسية:

فصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المغناطيسي هو طريقة بسيطة وفعالة تُستخدم حاليًا. تتوفر حاليًا العديد من الحوامل المغناطيسية تجاريًا ومضمنة في مجموعات. تستخدم الحوامل المغناطيسية التي تحتوي على ليغاندات مصنوعة من بوليمرات حيوية تميل إلى الأحماض النووية المستهدفة في عملية الفصل. يتم استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام حبات مغناطيسية من عينات مختلفة، خاصةً الفيروسات، البكتيريا، والدم. تتميز الحبات المغناطيسية بصغر حجمها، وسطحها مغطى بمواد مشحونة يمكن أن ترتبط بـ الحمض النووي الريبوزي. (RNA)

عند إضافة الحبات المغناطيسية إلى العينة البيولوجية المستهدفة، يتم جذب مكونات الخلايا الممزقة إلى الأقطاب المغناطيسية، مما يؤدي إلى فصل المكونات الأخرى عن الحمض النووي الريبوزي (RNA). يتم وضع الحمض النووي الريبوزي (RNA) المرتبط بالحبات المغناطيسية في محاليل ملحية لفصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن الحبات. على الرغم من أن نسبة نقاء الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص بهذه التقنية مرتفعة، إلا أن تكلفتها مرتفعة، لذا لم تصبح طريقة روتينية في المختبرات بعد.

الخلاصة

يعد استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الجودة الخطوة الأولى والأساسية لإجراء العديد من التقنيات الجزيئية مثل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) العكسي (RT-qتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR))، وتحليل الترانسكريبتوم باستخدام التسلسل، وتحليل المصفوفات، وتقنية Northern blot، وتخليق cالحمض النووي (DNA). بالإضافة إلى بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)، تؤثر عوامل مختلفة على جودة هذه البيوماركرات الحيوية، مثل جودة العينة البيولوجية والمواد المستخدمة، وطريقة تخزين الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص. بالإضافة إلى اختيار الطريقة الصحيحة للاستخراج وإعداد طريقة العمل، يجب مراعاة بعض النقاط الهامة في استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) لضمان أن يكون الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص مقبولًا من حيث الكمية والجودة.