لتقدير تركيز البروتين BCA اختبار
مقدمة:
اختبار BCA (حمض البيسينشونينيك) هو طريقة لونية من مرحلتين تستخدم لتحديد الكمية الكلية للبروتين في عينة. تعتمد هذه الطريقة على تفاعل البيوريت، حيث يتم اختزال أيونات النحاس الثنائي (Cu²⁺) إلى أيونات النحاس الأحادي (Cu¹⁺) بواسطة البروتينات في بيئة قلوية. تشكل سلسلة الأحماض الأمينية معقدًا لونيًا مع أيونات النحاس، مما يمكّن من الكشف الحساس والانتقائي لأيونات النحاس الأحادي. كمية النحاس الثنائي المختزل تعتمد على تركيز البروتين، والذي يمكن تحديده بطريقة الطيف الضوئي من خلال تغيير لون محلول العينة من الأزرق إلى الأرجواني، والذي يتم امتصاصه عند 562 نانومتر باستخدام أجهزة مثل الطيف الضوئي، NanoDrop، وقارئات الألواح الدقيقة. بشكل محدد، تركيز البروتين في المحلول يتناسب مع الامتصاص المقاس بواسطة هذه الأجهزة، مما يسمح بتقديره مقارنةً بمعيار بروتين معروف مثل الألبومين البقري (BSA).
في طريقة BCA، يمكن أن تحدث بعض التداخلات، بعضها بناء وبعضها قد يتسبب في تعطيل العملية. من بين التداخلات البناءة يمكن الإشارة إلى المواد المنظفة الأيونية وغير الأيونية والمواد الشيلاتية (مثل NP-40، Emulgen، HEPES، DTT، Triton X-100، اليوريا، غوانيدين HCl، أسيتات الصوديوم عند pH 5.5). أما التداخلات التي يمكن أن تعطل الاختبار فتشمل:
بعض المواد الكيميائية، مثل حمض الإيثيلين ديامين تتراستيك (EDTA)، التي يمكن أن تتداخل مع اختبار BCA عن طريق تقليل السكريات والدهون.
وجود بقايا كيميائية معدلة في البروتينات.
لتقليل تأثير التداخلات المسببة للاضطرابات، يمكن اتباع بعض الاستراتيجيات:
تقليل المواد المداخلة من خلال الدياليز.
الترشيح الهلامي.
إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا بما فيه الكفاية، يمكن تقليل تأثير التداخل عن طريق تخفيف العينة.
بشكل عام، تعتبر طريقة BCA من الطرق التي تتمتع بالعديد من المزايا، حيث يمكنها اكتشاف البروتينات بتركيزات منخفضة تصل إلى 5 ميكروغرام لكل مل، مما يعني أنها حساسة للغاية ويمكن أن تغطي مجموعة واسعة من تركيزات البروتين.
طريقة لوري
تستخدم طريقة لوري لتحديد الكمية الكلية للبروتين في مصل الدم. تشبه هذه الطريقة اختبارات لونية أخرى، حيث تتطلب رسم منحنى قياسي يجب إعداده قبل قياس تركيز البروتينات في العينات.
باختصار، تتكون طريقة لوري من مرحلتين من التفاعلات. في المرحلة الأولى، تتفاعل ذرات النيتروجين في الروابط الببتيدية للبروتينات مع كبريتات النحاس الثنائي (CuSO₄) في محلول قلوية، مما يؤدي إلى اختزال Cu²⁺ إلى Cu⁺ وتشكيل معقد بروتين-نحاس باللون الأرجواني. في المرحلة الثانية، يتم إضافة مادة فولين، وتؤدي التفاعلات الناتجة إلى تحول لون المحلول إلى الأزرق، والذي يمكن قراءته باستخدام الطيف الضوئي في نطاق الطول الموجي من 650 إلى 750 نانومتر.
عادةً ما تكون الكواشف والمعايير المستخدمة في هذه الطريقة متاحة تجاريًا في مجموعات جاهزة لاختبار تركيز البروتين (طريقة لوري).
ملاحظة: نظرًا لأن NanoDrop يمكنه قياس تركيزات بروتين أعلى من أجهزة الطيف الضوئي التقليدية التي تعتمد على الكوفيت، فقد تحتاج إلى معايير بتركيزات أعلى مما هو موضح في تعليمات المجموعة التجارية.
تتطلب هذه الطريقة وقتًا أطول مقارنةً بالطرق الأخرى، ولكن يمكن تقليل هذا الوقت قليلاً بزيادة درجة الحرارة. من بين مزايا هذه الطريقة يمكن الإشارة إلى دقتها وحساسيتها. المركبات التي تُستخدم عادةً في المحاليل لتحضير البروتين (مثل المنظفات، الكربوهيدرات، الجليسرول، التريس، EDTA) قد تتداخل مع اختبار لوري وتؤدي إلى تكوين رواسب.
طريقة برادفورد
اختبار بروتين برادفورد هو تقنية تم تطويرها بواسطة برادفورد (1976) لقياس تركيز البروتين الكلي في عينة. تُستخدم أساسًا لقياس تركيز البروتينات في الفractions الخلوية وتقييم تركيز البروتين في جيلاتين electrophoresis. يعتمد مبدأ هذه الطريقة على أن ارتباط جزيئات البروتين بصبغة كوماتسي في ظروف حمضية يؤدي إلى تغيير اللون من البني إلى الأزرق. تقيس هذه الطريقة بشكل خاص وجود بقايا الأحماض الأمينية الأساسية، مثل الأرجينين، الليزين، والهيستيدين، التي تساهم في تشكيل معقد البروتين-الصبغة. من المهم أن نلاحظ أن ارتباط كوماتسي الأزرق بالأرجينين له دلالة كبيرة، حيث إن كمية الصبغة المرتبطة تعتمد على محتوى الأحماض الأمينية الأساسية في البروتين. على عكس طريقة BCA، فإن العوامل المختزلة (مثل DTT والبيتا-ميركابتو إيثانول) والشيلاتورات المعدنية (مثل EDTA، EGTA) لا تتداخل عند التركيزات المنخفضة. ومع ذلك، فإن وجود SDS حتى في التركيزات المنخفضة يمكن أن يتداخل مع ارتباط البروتين بالصورة. هذه التقنية أقل حساسية للعوامل المعيقة مقارنةً بطريقة لوري.
مزايا طريقة برادفورد:
أسرع وأسهل مقارنة بالطرق الأخرى.
يتم القياس في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة إلى معدات خاصة.
تحضير الكواشف لهذه الطريقة سهل، واللون الناتج مستقر ويتشكل بسرعة.
متوافقة مع معظم الأملاح، والمذيبات، والمحاليل، والثيولات، والعوامل المختزلة والشيلات في العينات البروتينية.
يمكن أتمتة الطريقة نظرًا لقلة المحاليل المطلوبة وبساطتها.
طريقة بيرس (Pierce)
تعد قياس الكمية الكلية للبروتين إجراءً شائعًا في مختبرات العلوم الحيوية، والصناعات البيودوائية، والأغذية والمشروبات. من بين الطرق الأكثر شيوعًا المستخدمة لتحديد الكمية الكلية للبروتين هي اختبارات الربط اللوني، مثل اختبار برادفورد المعتمد على كوماتسي. رغم أن طريقة برادفورد تُستخدم على نطاق واسع، إلا أن لديها عدة عيوب. العديد من المواد، بما في ذلك بعض المنظفات، الفلافونويدات، والأجهزة العازلة للبروتين، معروفة بأنها تتداخل مع الخصائص اللونية المعتمدة على هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن خطية اختبار برادفورد محدودة من حيث الجودة والنطاق. إن التوافق الواسع مع المواد وتحسين خطية اختبار 660 نانومتر من بيرس، إلى جانب تنسيقه البسيط وذو الكاشف الواحد، يجعله طريقة أكثر دقة وسهولة للعديد من التطبيقات المعتادة.
اختبار بروتين 660 نانومتر من بيرس هو طريقة لونية سريعة وجاهزة لتحديد الكمية الكلية للبروتين. هذه الطريقة متكررة، أسرع، وأكثر خطية من طريقة برادفورد. علاوة على ذلك، فإن اختبار بروتين 660 نانومتر من بيرس متوافق مع التركيزات العالية من الكواشف الشائعة المستخدمة، مثل المنظفات والعوامل المختزلة. كما هو الحال في طريقة برادفورد، يتم تقدير تركيز البروتين بالإشارة إلى سلسلة من تخفيفات البروتين القياسية التي تم اختبارها جنبًا إلى جنب مع العينات غير المعروفة. كل طريقة قياس البروتين الكلي تظهر درجات متفاوتة من الاستجابة تجاه بروتينات مختلفة. ترتبط هذه الاختلافات بتغيرات في تسلسل الأحماض الأمينية، ونقاط الأيزوإلكتريك، والبنية، ووجود سلاسل جانبية معينة أو مجموعات صناعية يمكن أن تغير بشكل كبير استجابة لون البروتين. لذلك، فإن اختيار بروتين مرجعي مناسب هو المفتاح لتحقيق نتائج عالية الجودة. البروتين المثالي للاستخدام كمعيار مرجعي في أي اختبار بروتين هو تحضير نقي من نفس البروتين الذي يجب قياسه في العينة. في غياب مثل هذا البروتين المرجعي، يمكن استخدام بروتين بديل ينتج استجابة لونية مشابهة للبروتين في العينة.
من البدائل الشائعة للبروتين المرجعي الألبومين البقري (BSA) والغاما جلوبولين البقري (BGG). عندما تحتوي العينة بشكل أساسي على الألبومين، أو يكون للبروتين في العينة استجابة لونية مشابهة لـ BSA، فإن BSA يعتبر معيارًا مناسبًا. بالنسبة للاستجابة اللونية التي تأتي من الأجسام المضادة المنقاة ومعظم الخلطات البروتينية غير المصلية (مثل lysates الخلوية)، فإن BGG هو بروتين معيار مناسب.