التألق المناعي (IFA) هو تقنية كيميائية حيوية هامة تسمح بالكشف والتفكيك عن مجموعة واسعة من المستضدات والأجسام المضادة داخل مقطع أنسجة أو خلايا. يمكن أيضًا وصفه بأنه طريقة مجهرية تستخدم مجهر التألق لتحديد الأجسام المضادة ضد مستضدات محددة. بالإضافة إلى ذلك، يعد طريقة تحديدية في علم الفيروسات للكشف عن وجود الأجسام المضادة بناءً على قدرتها الخاصة على التفاعل مع المستضدات الفيروسية المعبر عنها في الخلايا المصابة، ويمكنه التعرف على البروتينات الفيروسية المعبر عنها في الخلايا من خلال تفاعلات المستضد-الجسم المضاد. ياُستخدم هذا الاختبار غالبًا لتأكيد المعطيات الإيجابية التي تم الحصول عليها بواسطة ELISA (اختبار الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم) أو MFIA® (اختبار الفلورسنت المناعي المتعدد). عادةً ما يُستعمل كاختبار تأكيدي، حيث يمكن رؤية مواقع تفاعلات الجسم المضاد-المستضد في الخلايا المصابة.
اعتمادًا على نطاق الاختبار أو الأجسام المضادة المحددة المستخدمة، هناك طريقتان متاحتان): الطريقة المباشرة (الأساسية أو )غير المباشرة (الثانوية.
· 1- الطريقة المباشرة الأساسية:
الفلورسنت المناعي المباشر (DIF) هو تقنية تُستعمل في المختبر لتشخيص الأمراض الجلدية، واضطرابات الكلى، وأنظمة الأعضاء الأخرى. تُعرف أيضًا باسم اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة أو الفلورسنت المناعي الأساسي. تستخدم الفلورسنت المناعي الأساسي أو المباشر جسمًا مضادًا واحدًا مرتبطًا كيميائيًا بفلوروفور. يتعرف الجسم المضاد على الجزيء الهدف ويرتبط به، ويصبح التألق المرتبط به قابلًا للكشف من خلال المجهر.
تقدم هذه التقنية عدة مزايا مقارنةً بالبروتوكول الثانوي (أو غير المباشر)، حيث يرتبط الجسم المضاد مباشرةً بمجهر التألق (الكروموفور). وهذا يقلل من عدد الخطوات في عملية التلوين، مما يجعلها أسرع. كما يمكنها تقليل الإشارة الخلفية من خلال تجنب بعض المشكلات المتعلقة بالتفاعل المتبادل أو عدم الخصوصية للجسم المضاد. ومع ذلك، نظرًا لأن عدد جزيئات مجهر التألق التي يمكن أن ترتبط بالجسم المضاد الأساسي محدود، فإن الفلورسنت المناعي المباشر لديه حساسية أقل مقارنةً بمجهر التألق المناعي غير المباشر.
· 2- الطريقة غير المباشرة الثانوية:
يستخدم مجهر التألق المناعي غير المباشر أو الثانوي جسمين مضادين. يرتبط الجسم المضاد الأول غير المعلم بشكل محدد بالجزيء الهدف، بينما يتعرف الجسم المضاد الثانوي، الذي يحمل فلوروفور، على الجسم المضاد الأول ويرتبط به. يمكن أن ترتبط العديد من الأجسام المضادة الثانوية بجسم مضاد أولي واحد، مما يعزز الإشارة من خلال زيادة عدد جزيئات المتألق عند كل مستضد.
هذا البروتوكول أكثر تعقيدًا ويتطلب وقتًا أطول مقارنةً بالبروتوكول الأساسي (أو المباشر)، ولكنه يوفر مرونة أكبر، حيث يمكن استعمال أنواع مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية وتقنيات الكشف لجسم مضاد أولي معين. تُستعمل هذه الطريقة على نطاق واسع كاختبار تأكيدي في تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية (HIV).
في البداية، تُزرع الخلايا المصابة بالفيروس على شرائح زجاجية معقمة بقطر 12 مم. لتثبيت المستضد، يتم تثبيت الخلايا باستعمال البارافورمالدهايد لتحضير البروتينات الموجودة في الخلايا للارتباط بالأجسام المضادة. يتم اختراق الخلايا باستعمال منظف ملائم، مثل Triton X-100. يتم تطبيق جسم مضاد محدد (مثل مصل المريض) على السطح لتحديد المستضد الفيروسي. ثم يتم تطبيق جسم مضاد ثانوي، محدد للمنطقة Fc لجسم مضاد IgG الأولي.
نظرًا لارتباط صبغة المتألق بالجسم المضاد الثانوي، يمكن رؤية المستضد تحت المجهر المتألق. يمكن الكشف عن تكرار المستضد الفيروسي داخل الخلايا باستعمال IFA. علاوة على ذلك، يمكن بسهولة رؤية اثنين أو حتى ثلاثة مستضدات في وقت واحد باستعمال اثنين إلى ثلاثة أجسام مضادة منفصلة.
تُقدم نتائج الاختبار على أنها إيجابية أو سلبية أو غير واضحة. حاليًا، ياُستخدم IFA لأغراض بحثية بدلاً من الأغراض التشخيصية. ومع ذلك، في الأيام الأولى عندما لم تكن مجموعات ELISA متاحة تجاريًا، اُستخدم IFA لأغراض تشخيصية باستعمال مصل المرضى كجسم مضاد أولي.
يتضمن التطبيق الفعال لهذه الطريقة عدة اعتبارات، بما في ذلك طبيعة المستضد، وخصوصية وحساسية الجسم المضاد الأولي، وخصائص العلامة الفلورية، وطرق الاختراق والتثبيت، وتصوير الفلورسنت للخلايا. على الرغم من أن كل بروتوكول يتطلب ضبطًا دقيقًا بناءً على نوع الخلية، والجسم المضاد، والمستضد، إلا أن هناك خطوات مشتركة تقريبًا لجميع الاستخدامات.
يمكن إجراء الفلورسنت المناعي على مقاطع الأنسجة، أو الخلايا المزروعة، أو الخلايا الفردية المثبتة باستعمال طرق مختلفة. يمكن استعمال الأجسام المضادة لتفكيك توزيع البروتينات، والجليكوبروتينات، وغيرها من الأهداف المستضدية، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة البيولوجية وغير البيولوجية.
يمكن تفكيك عينات التألق المناعي باستعمال أنواع مختلفة من مجهر الفلورة. أبسط نوع هو مجهر الفلورة فوق البنفسجي. بينما يُستعمل المجهر التوافقي على نطاق واسع، فإن التصاميم الأحدث للمجاهر ذات الدقة الفائقة، مثل مجهر STED (تخريب انبعاث التحفيز) وغيرها، تمكن من التصوير على المتحديد النانوي بدقة أعلى بكثير.
مزايا التألق المناعي (IFA)
تعتبر هذه الطريقة متدنية التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم المورفولوجيا وموقع التألق لتمييز التفاعلات الخاصة من غير المحددة.
عيوب التألق المناعي
بسبب القيود المرتبطة بالأداء، لا يُعتبر IFA أداة غربلة أولية للاختبارات المصلية. تتطلب هذه الطريقة مجهرًا فلوريًا. التفسيرات قد تكون ذاتية، والمعطيات ليست كمية، وغالبًا ما تكون محدودة بمستضد واحد لكل شريحة. التألق غير المحددة شائعة، وشدة الفلورسنت يمكن أن تتفاوت. مثل جميع الاختبارات المصلية، لا يكتشف IFA الكائنات الحية المعدية؛ بل يشير فقط إلى علامة على عدوى سابقة. نظرًا لأن الحيوانات لا تنتج أجسامًا مضادة، فإن IFA غير ملائم للاستعمال في الحيوانات ذات المناعة الضعيفة.
اختيار الأجسام المضادة بعناية: اختيار الأجسام المضادة الأولية والثانوية الملائمة أمر بالغ الأهمية. يجب أن ترتبط الأجسام المضادة بشكل خاص بالمستضد المستهدف وأن تكون ذات جودة عالية.
التحكمات الإيجابية والسلبية: من الضروري استعمال التحكمات الإيجابية والسلبية لضمان دقة وصحة المعطيات. تساعد هذه التحكمات في تحديد الارتباط المحدد للأجسام المضادة وإزالة الضوضاء الخلفية.
الدقة في خطوات الغسل: يجب تنفيذ خطوات الغسل بدقة وبشكل كامل. قد يؤدي غسل غير مكتمل إلى الضوضاء الخلفية وتقليل دقة المعطيات.
استعمال المحاليل الملائمة: استعمال المحاليل الملائمة للتثبيط، والتخليل، والغسل أمر حاسم. يمكن أن تساعد المحاليل عالية الجودة في تحسين الدقة وتقليل الضوضاء الخلفية.