تنقية الأجسام المضادة متعددة النسائل
مقدمة:
الأجسام المضادة متعددة النسائل (pAbs) هي مزيج معقد من عدة أجسام مضادة تُنتج عادةً بواسطة مستعمرات مختلفة من خلايا B في حيوان. هذه الأجسام المضادة تتعرف على وتربط عدة إبيتوبيات مميزة على مستضد، مما يسمح لها بتشكيل شبكات مع المستضدات. كل جسم مضاد فردي يتعرف على إبيتوبي فريد موجود على المستضد. تعمل الأجسام المضادة متعددة النسائل من خلال عملية تُعرف بتعرف المستضد-الجسم المضاد. عندما يدخل مستضد إلى الجسم، تقوم خلايا B بتحديد مناطق معينة تُعرف بالإبيتوبيات على سطح المستضد وتربط بها. يؤدي هذا إلى تنشيط خلايا B، مما يؤدي إلى تمايزها إلى خلايا بلازما، التي تقوم بعد ذلك بإفراز الأجسام المضادة، كل منها يحمل خصوصية ارتباط فريدة، في مجرى الدم.
تسمح الأجسام المضادة المتنوعة التي تُنتج أثناء الاستجابة المناعية للأجسام المضادة متعددة النسائل باستهداف عدة إبيتوبيات على مستضد معين. تزيد هذه الخصوصية الواسعة من قدرتها على التعرف على الارتباط بمناطق مختلفة من المستضد، مما يؤدي إلى معدل نجاح أعلى في التعرف على المادة الخارجية المستهدفة، وحيادها، وإزالتها.
إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسائل
تحضير المستضد
تؤثر جودة وكمية المستضد المستخدم بشكل مباشر على الاستجابة المناعية. حتى كميات صغيرة من الشوائب يمكن أن تؤدي إلى استجابة الأجسام المضادة ضد الشوائب بدلاً من المستضد المطلوب. قد تؤدي كميات غير كافية أو مفرطة من المستضد إلى تحسس أو قمع أو آثار تعديل مناعي أخرى غير مرغوب فيها. لذا، فإن تنقية المستضد هي عملية حيوية لتحقيق زيادة في خصوصية الجسم المضاد.
يجب تحضير المستضد في ظروف معقمة لضمان خلوه من الإندوتوكسين. يعتمد مقدار المستضد على عوامل متعددة، بما في ذلك الخصائص المحددة للمستضد، ونوع الحيوان المختار، وطريقة الحقن، وتكرار الحقن، ومستوى نقاء المستضد.
اختيار أنواع الحيوانات
تشمل العوامل التي تؤثر على اختيار أنواع الحيوانات: كمية pAb المطلوبة، العلاقة فيلو جينية بين الحيوان والمستضد، عمر الحيوان، سهولة أخذ عينات الدم، والتطبيق الذي سيتم فيه استعمال pAb. تشمل الحيوانات الشائعة المستخدمة في المختبر: الأرانب، الفئران، خنازير غينيا، الهامستر، الماعز، الدجاج، والأغنام. تُفضل الأرانب بسبب حجمها وطول عمرها النسبي. ومع ذلك، لإنتاج كميات أكبر من pAbs، تُستعمل الحيوانات الزراعية مثل الماعز والأغنام والخيول.
بروتوكول التحصين
يختلف بروتوكول التحصين بين أنواع الحيوانات المختلفة. تعتبر المعززات (Adjuvants) مركبات تُستعمل كمحفزات عندما تكون الاستجابة المناعية المستحثة غير كافية. أكثر المعززات شيوعًا المستخدمة في إنتاج pAbs هو المعزز الكامل من فروند (FCA)، الذي يحفز مستوى عالٍ من الأجسام المضادة ضد معظم أنواع المستضدات. ومع ذلك، يجب الحذر من عدم إعطاء FCA بجرعات مفرطة، حيث يمكن أن يسبب ذلك ضررًا شديدًا للأنسجة.
يتم حقن الحد الأدنى من حجم المستضد القادر على تحفيز استجابة مناعية فعالة في الحيوان. ومع ذلك، يعتمد مسار الحقن على طبيعة المستضد وكذلك الحيوان المستخدم. يمكن إعطاء المستضد كحجم واحد أو كأحجام صغيرة متعددة في مواقع حقن مختلفة.
إذا وصلت مقدارات الأجسام المضادة إلى مستوى ثابت أو بدأت في الانخفاض، يتم إجراء حقن تعزيز. لا تتطلب هذه الحقن دائمًا معززًا، وغالبًا ما تكون كميات صغيرة جدًا من المستضد كافية لتحسين مقدار الأجسام المضادة. يُوصى بحد أقصى من ثلاث حقن تعزيز.
المراقبة بعد التحصين
تُراقب الحيوانات يوميًا لتقييم أي آثار جانبية للتحصين، ويتم أخذ عينات الدم منها على فترات منتظمة. يتم تفكيك مصل الحيوانات لمراقبة استجابات الأجسام المضادة واستخراج الأجسام المضادة إذا تم إنتاج كميات كافية.
تطبيقات الأجسام المضادة متعددة النسائل
الاختبارات التشخيصية : تمتلك pAbs مجموعة واسعة من الاستخدامات، بما في ذلك الاختبارات التشخيصية والتفكيكات البيولوجية الكمية والنوعية. على سبيل المثال، تُستعمل pAbs في طرق الفلورسنت المناعي (Immunofluorescence) والأنسجة المناعية (Immunohistochemistry) لتحديد علامات الأورام والبروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
الأغراض العلاجية أو التعديلية : تُستعمل pAbs أيضًا لأغراض الوساطة أو التعديل مثل العلاج المناعي، الإشارات النشطة، أو للأنشطة المحايدة. مثال على ذلك هو استعمال pAbs في معالجة السموم الناتجة عن الديجوكسين.
الوقاية من مرض الانحلال : يتم حقن pAbs مثل الغلوبولين المناعي Rho(D) للأمهات ذوات فصيلة الدم السلبية Rh لمنع مرض الانحلال في حديثي الولادة. يتم إنتاج Rho(D) من بلازما بشرية تم جمعها من متبرعين سلبين لديهم أجسام مضادة ضد المستضد D الموجود على خلايا الدم الحمراء.
التفكيكات الهيستوباثولوجية : تُستعمل pAbs أيضًا في التفكيكات الهيستوباثولوجية التي تستخدم صبغة الإنزيم المناعي. بالإضافة إلى هذه الاستخدامات، تُستعمل pAbs في التطهير المناعي لعزل أو إثراء المستضدات.
الأجسام المضادة البوليفونية المؤتلفة : تُستعمل pAbs المؤتلفة بسبب قدرتها على استهداف عدة أنواع من خلايا الأورام مقارنةً بالأجسام المضادة الأحادية النسيلة في علاج السرطان. تُستعمل الأجسام المضادة الأحادية النسيلة على نطاق واسع في علاج السرطان، ولكن تكرار المرض بسبب ظهور خلايا الأورام المقاومة للأجسام المضادة شائع. باستعمال pAbs، يمكن إنتاج أجسام مضادة مؤتلفة متنوعة تتفاعل مع أنواع مختلفة من السرطانات.
الاتجاهات المستقبلية : تشير الاتجاهات المستقبلية إلى استعمال pAbs المؤتلفة لتقليل التفاعلات العديدة غير الضرورية، كما يحدث عند استعمال pAbs التقليدية. إن استعمال pAbs في اختبارات مختلفة لا يعزز فقط القدرة على الإنتاج، بل قد يُستعمل أيضًا لإنتاج أجسام مضادة خاصة لمنتجات الجين البشري القابلة للتجديد.
الخاتمة
تُنتج الأجسام المضادة متعددة النسائل باستعمال عدة خلايا مناعية مختلفة. تتجه هذه الأجسام المضادة نحو مستضد واحد ولكنها تتعرف على إبيتوبيات مختلفة، بينما تُنتج الأجسام المضادة الأحادية النسيلة من خلايا مناعية متطابقة، جميعها مستعمرات من خلية والد واحدة معينة. بالنسبة للتطبيقات مثل إنتاج الأدوية العلاجية التي تتطلب كميات كبيرة من الأجسام المضادة الموحدة الخاصة بإبيتوبي معين، تعتبر الأجسام المضادة الأحادية النسيلة حلاً أفضل. ومع ذلك، بالنسبة للتطبيقات البحثية العامة، فإن مزايا الأجسام المضادة البوليفونية غالبًا ما تفوق الفوائد المحددة التي تقدمها الأجسام المضادة الأحادية النسيلة. مع تنقية ميل التركيب في المصل ضد الأهداف المستضدية الصغيرة، تزداد مزايا الأجسام المضادة متعددة النسائل.
تنقية الأجسام المضادة
تُعتبر الأجسام المضادة جزءًا هامًا من الجهاز المناعي. عندما يتعرض الجسم لمستضد، يقوم النظام المناعي بإنتاج جسم مضاد محدد لذلك المستضد. تستفيد التقنيات المستخدمة عادةً في البيوتكنولوجيا من هذه العملية المناعية الطبيعية. تُستعمل الأجسام المضادة في العديد من الاستخدامات البحثية وكذلك في الفحوصات المناعية لتشخيص الأمراض. تُستعمل خصائص ارتباط المستضد/الجسم المضاد للكشف عن المناعية وتحديد ELISA. نستخدم الأجسام المضادة المرتبطة بفلوروفور أو علامات إنزيمية لتوسيم الأهداف الجزيئية على الخلايا والأنسجة الكاملة. تُستعمل تنقية الأجسام المضادة لتشخيص الأمراض. تُستخلص هذه الأجسام المضادة، اعتمادًا على التطبيق، عادةً من خلال تنقية الأجسام المضادة من البشر، أو الفئران، أو الأرانب، أو الدجاج.
الأجسام المضادة متعددة النسائل مقابل الأحادية النسيلة
تُستخلصالأجسامالمضادةالتينستخدمهامنالمصل (الأجسامالمضادةمتعددةالنسائل) أومنخطوطخلاياالهيبريد (الأجسامالمضادةالأحاديةالنسيلة). تُجمعالأجسامالمضادةمتعددةالنسائلمنخلايا B مختلفة،ممايعنيوجودتنوعأكبرفيالتعرفعلىإبيتوبياتالمستضد. الأجسامالمضادةالأحاديةالنسيلةمتطابقةلمستضدمعينوتت recognize the same epitope. تعتمدنوعيةالجسمالمضادالمطلوبعلىأهدافالطريقةالمستهدفة
ثلاث طرق رئيسية لتصفية الأجسام المضادة
لتنقية الأجسام المضادة، من الضروري مطابقة طريقة التنقية مع نوع الجسم المضاد والهدف المقصود. هناك ثلاث طرق رئيسية لتصفية الأجسام المضادة. الطريقة الأكثر شيوعًا، والتي تتمتع بخصوصية أقل في تنقية الأجسام المضادة، تتضمن الفصل البسيط للأجسام المضادة عن البروتينات الأخرى بناءً على الحجم والتركيب. تؤدي هذه الطريقة إلى تنقية جميع الأجسام المضادة بغض النظر عن النوع وارتباط المستضد. الخطوة التالية هي العزل الانتقائي لفئة معينة من الأجسام المضادة (مثل IgG، IgM، IgA، IgL، IgE) باستعمال بروتينات مثل A أو G التي تعتمد على فئات معينة من الأجسام المضادة. أكثر طرق تنقية الأجسام المضادة تحديدًا هي الامتصاص المحدد للمستضد، والتي تتطلب في كثير من الأحيان ربط المستضد بدعم صلب. تُعتبر الخرزات المغناطيسية مفيدة بشكل خاص لتنقية الأجسام المضادة المخصصة لمستضد معين وفئة معينة. تقليديًا، تُستعمل الأعمدة أو الخرزات الراتنجية كدعم صلب، حيث يتم امتصاص الجسم المضاد إلى مستضد أو بروتين معين، ثم يتم جمعه. يكون ارتباط الجسم المضاد أكثر فعالية عند pH فسيولوجي. إذا تم رفع أو خفض pH بشكل كبير، فإن الارتباط بين الجسم المضاد والمستضد أو الجسم المضاد والبروتين سيتعطل. ثم يتم غسل الجسم المضاد من العمود ويمكن جمعه لاستكمال عملية تنقية الجسم المضاد. إذا تعذر تثبيت البروتين الممتص على دعم صلب، فهناك خيار لاستعمال بروتينات اندماج أو علامات HIS6 حمض الهيستيدين الأميني.
يمكن استعمال طرق تنقية أقل صرامة لجمع الأجسام المضادة الأحادية النسيلة من خطوط خلايا الهيبريد، حيث إنها مصدر مُراقب للغاية. في المقابل، تتطلب الأجسام المضادة متعددة النسائل أكثر طرق التصنيع صرامة لأنها تحتوي على العديد من البروتينات والأجسام المضادة في المصل. تُعتبر المناعية جزءًا مهمًا من العلوم البيولوجية، ولن تكون ممكنة بدون استراتيجيات تنقية الأجسام المضادة التي تُنتج مجموعات ثابتة وموثوقة من الأجسام المضادة.
الطرق العامة لتنقية الأجسام المضادة
1- تنقية الأجسام المضادة بواسطة الفصل الفيزيائي الكيميائي:
في طريقة الفصل الفيزيائي الكيميائي—ترسيب تفاضلي، يتم فصل الأجسام المضادة بناءً على الحجم، الشحنة، أو خصائص كيميائية أخرى مشتركة في العينات النموذجية، مما يؤدي إلى عزل مجموعة فرعية من البروتينات التي تشمل الأجسام المضادة.
تشمل الطرق الفرعية لهذه الطريقة:
كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
ترسيب كبريتات الأمونيوم
كروماتوغرافيا تبادل الأيونات(Ion exchange chromatography)
كروماتوغرافيا مخلب المعدن المثبت(Immobilized metal chelate chromatography)
امتصاص ثيوفيلي (Thiophilic adsorption)
يمكن استعمال دیالیز، إزالة الأملاح، وديافیلتراسیون لتبادل الأجسام المضادة إلى محاليل خاصة وإزالة المكونات غير المرغوب فيها ذات الوزن الجزيئي المنخفض (MW). يمكن استعمال أغشية الديالیز، والراتنجات، وأجهزة الدیافیلتراسیون ذات القطع الجزيئي العالي (MWCO) لعزل الأيمونوجلوبولينات (> 140 كيلو دالتون) من البروتينات الصغيرة والببتيدات. لا يمكن لهذه التقنيات بمفردها تنقية الأجسام المضادة من البروتينات والماكرومولكولات الأخرى الموجودة في عينات الأجسام المضادة العادية، والتنقية ممكنة فقط باستعمال الأعمدة والمعدات المتخصصة. عادةً، تُستعمل ترشيح الجل والديالیز بعد خطوات تنقية أخرى، مثل ترسيب كبريتات الأمونيوم.
يُستعمل ترسيب كبريتات الأمونيوم غالبًا لتغنيق ومقدار الأجسام المضادة من المصل، أو السائل البطني، أو السائل العلوي لزراعة الخلايا. تترسب الأجسام المضادة عند مقدارات أقل من كبريتات الأمونيوم مقارنةً بالبروتينات والمكونات الأخرى في المصل. هذه الطريقة في التنقية ملائمة لبعض تطبيقات الأجسام المضادة، ولكن غالبًا ما تُستعمل كخطوة تمهيدية قبل الكروماتوغرافيا العمودية أو طرق التنقية الأخرى.
في الكروماتوغرافيا لتبادل الأيونات (IEC)، تُستعمل راتنجات ذات شحنة إيجابية أو سلبية لربط البروتينات بناءً على شحناتها الصافية في نظام عازلة محدد (pH). تُعتبر IEC طريقة فعالة من حيث التكلفة، وهادئة، وموثوقة لتنقية الأجسام المضادة.
تستخدم الكروماتوغرافيا المعتمدة على المعادن الثابتة (IMAC) أيونات المعادن الثنائية مثل النيكل لربط البروتينات أو الببتيدات التي تحتوي على علامة هيستيدين (غالبًا ما توجد في البروتينات المؤتلفة المهندسة). ومن المثير للاهتمام أن IgGs من الثدييات هي واحدة من البروتينات الوفيرة القليلة في المصل (أو السائل العلوي لزراعة خلايا هيبريدما أحادية النسيلة) التي تحتوي على أحماض أمينية هيستيدين، والتي يمكن أن ترتبط بالنيكل الثابت. تُستعمل العديد من أيونات المعادن الأخرى، مثل الكوبالت، والمغنيسيوم، والزنك، والكالسيوم، والحديد، كليغاندات في الكروماتوغرافيا المعتمدة على المعادن.
2- التنقية بالتخصص الطبقي للأجسام المضادة
تستخدم طريقة التنقية بالتخصص الطبقي روابط ثابتة من الفئة الواحدة تربط فئات معينة من الأجسام المضادة (مثل IgG) من خلال روابط بيولوجية (بروتينات، لكتينات، إلخ) لها ميل خاص تجاه الأيمونوجلوبولينات. في هذه الطريقة، يتم تنقية جميع الأجسام المضادة من الفئة المستهدفة بغض النظر عن الخصائص المستضدية.
روابط الأجسام المضادة بروتين A، G، وL
تُعتبر بروتينات A وG وL ثلاثة بروتينات بكتيرية معروفة بخصائص ربط الأجسام المضادة الخاصة بها. يتم إنتاج هذه البروتينات بشكل مؤتلف وتستخدم عادةً لتنقية أنواع رئيسية من الأجسام المضادة من أنواع مختلفة. معظم الأشكال المؤتلفة لهذه البروتينات المتاحة تجاريًا قد أُزيلت منها تسلسلات غير ضرورية، بما في ذلك مجال الارتباط HSA من بروتين G، مما يجعلها أصغر من نظيراتها الأصلية. كما يتوفر شكل مؤتلف معدل وراثيًا من بروتين A وبروتين G يعرف باسم بروتين A/G. تُستعمل جميع البروتينات الأربعة المرتبطة بالأجسام المضادة عادةً من قبل الباحثين في العديد من الاستخدامات التشخيصية والمناعية.
تشمل الطرق الفرعية لهذه الطريقة:
تنقية الأجسام المضادة باستخدام بروتينات A، G، وL
تنقية IgM
تنقية IgA
تنقية IgY من الدجاج
لتخليص الأجسام المضادة باستخدام بروتينات A، G، A/G، أو L، يتم ربطها بشكل تساهمي بالرواسب المسامية أو الكريات المغناطيسية. نظرًا لاحتواء هذه البروتينات على عدة مجالات ربط مع الأجسام المضادة، فإن أي جزيء مُثبت تقريبًا يحتفظ على الأقل بمجال ربط وظيفي واحد وغير معرقل بغض النظر عن الاتجاه. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن البروتينات ترتبط بالأجسام المضادة في أجزاء أخرى غير مجال ربط المستضد، يمكن استخدامها في التنقية. تمتلك بروتينات A وG وA/G وL خصائص ربط مختلفة، مما يجعل كل منها مناسبًا لمجموعة متنوعة من أهداف الأجسام المضادة. من المهم ملاحظة أن استخدام بروتين A أو G أو L يؤدي إلى تنقية الأيمونوجلوبولين العامة من عينة خام.
بالنسبة للأجسام المضادة IgM من الفئة M التي تحتوي على النوع المناسب من سلسلة الضوء (VL-kappa)، يمكن استخدام بروتين L للتنقية، على الرغم من أن IgGs التي تحتوي على نفس نوع سلسلة الضوء تُنقى أيضًا. تتطلب التنقية على النطاق الصناعي والتجاري لهذه الفئة من الأجسام المضادة مجموعة من التقنيات.
يُعتبر اللكتين بروتينًا سكريًا يزن حوالي 40 كيلو دالتون ويتكون من أربعة وحدات فرعية متطابقة. وهو مفيد في تنقية المصل البشري أو IgA السري. يوفر ligand الميل التركيبي إمكانية تنقية أو إزالة IgA من IgG وIgM الأكثر وفرة في المصل أو حليب الأم.
تنتج الدجاجات جزيءًا مناعيًا فريدًا يسمى IgY. تنتج الدجاجات أجسامًا مضادة أكثر بـ 15 إلى 20 مرة من الأرانب. يحتوي صفار البيض من دجاجة مُلقحة على حوالي 300 ملليجرام من IgY. يمكن جمع البيض الكامل أو صفار البيض المنفصل وتخزينه في الفريزر لاستخراج الأجسام المضادة لاحقًا.
3- التنقية الخاصة بالمستضد للأجسام المضادة
في هذه الطريقة، يتم تنقية تمام الأجسام المضادة التي ترتبط بالمستضد بغض النظر عن الفئة أو الإيزوتيب الخاص بالأجسام المضادة. على الرغم من أن بروتينات A وG وA/G وL هي روابط مهمة جدًا لتخليص IgG الكلي من عينة، إلا أنه في العديد من الحالات، تكون الحاجة ملحة لتخليص الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد. في هذه الطريقة، يتم تثبيت مستضد معين (يستخدم في التحصين) لتنقية آنذاك الأجسام المضادة التي ترتبط بشكل خاص بهذا المستضد.
تثبيت وتقديم المستضد
مستضدات الببتيد وروابط الميل التركيبي
مستضدات البروتين وروابط الميل التركيبي
ظروف الربط والإزالة
تعتمد الطرق ودرجة النقاء على التطبيقات المقصودة للأجسام المضادة.