اختبار الموت الخلوي المبرمج
مقدمة:
الاستماتة، أو الموت الخلوي المبرمج (Apoptosis)، هي عملية بيولوجية منظمة تُسهم بشكل أساسي في نمو الأنسجة، وتنظيم الاستجابة المناعية، والحفاظ على توازن البيئة الخلوية داخل الجسم.
تُعد دراسة الاستماتة ذات أهمية كبيرة في مجالات البحث العلمي، خاصة في علم الأورام، علم المناعة، وأبحاث تطوير العلاجات الدوائية.
يمكن تقييم الاستماتة بشكل فعال باستخدام تقنية الفلوسيتومتري (التدفق الخلوي - Flow Cytometry)،
حيث تظهر الخلايا الخاضعة للموت المبرمج تغييرات مميزة تشمل:
التغير في الشكل الخلوي (Cell Morphology).
فقدان تكامل الغشاء البلازمي (Plasma Membrane Integrity).
انخفاض إمكانات الغشاء الميتوكوندري (Mitochondrial Membrane Potential).
تجزئة الحمض النووي (DNA Fragmentation).
من خلال تحليل هذه التغيرات باستخدام الوسائل الفلورية والأصباغ الخاص،مثل انكسين V أو الكاسبات النشطة. يمكن للباحثين تحديد نسبة الخلايا الخاضعة للاستـماتة داخل العينة، وفهم الآليات الجزيئية المشاركة في تحفيز هذه العملية.
طرق تقييم الاستماتة باستخدام الفلوسيتومتري
توجد عدة طرق لتقييم الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة) باستخدام تقنية الفلوسيتومتري، وكل طريقة تتمتع بمزايا وقيود خاصة بها.
من الطرق الشائعة الاستخدام:
تلوين Annexin V:
يُستخدم للكشف عن التعرض الخارجي للفوسفاتيديل سيرين (Phosphatidylserine)، وهو علامة مبكرة ومميزة لبدء الاستماتة.
يرتبط بروتين Annexin V، الموسوم بصبغة فلورية، بجزيئات الفوسفاتيديل سيرين التي تنتقل إلى السطح الخارجي للغشاء الخلوي أثناء المراحل المبكرة للاستـماتة.
باستخدام تلوين مزدوج مع يوديد البروبيديوم (PI)، يمكن التمييز بين:
الخلايا المستميتة (Annexin V )إيجابية / PI سالبة.
الخلايا النخرية (Annexin V) إيجابية / PI إيجابية.
أما الطريقة الأخرى استخدام أصباغ مرتبطة بالحمض النووي:
تُستخدم أصباغ مثل Hoechst 33342 أو DAPI للكشف عن الخلايا المستميتة التي تظهر خصائص مميزة، مثل تكثف الكروماتين أو تجزئة النواة.
يمكن دمج هذه الأصباغ مع اختبارات أخرى، مثل:
قياس نشاط إنزيمات الكاسبيز. (Caspase Activity Assays)
تقييم إمكانات الغشاء الميتوكوندري باستخدام أصباغ متخصصة.
خصائص الإستماتة
تُعد تنشيط إنزيمات الكاسبيز (Caspase) واحدة من السمات الجوهرية للموت الخلوي المبرمج.
تُعتبر الكاسبيزات من أهم المنظمات الرئيسة لعملية الاستماتة، حيث تساهم في بدء سلسلة من التفاعلات البيوكيميائية التي تنتهي بتفكك الخلية بطريقة منظمة.
تُتيح تقنية الفلوسيتومتري تحليل وتحديد تنشيط الكاسبيزات في الخلايا الفردية بشكل كمي ودقيق، مما يوفر وسيلة موثوقة لدراسة ديناميكية الاستماتة.
تقييم الاستماتة باستخدام الفلوسيتومتري والكاسبيزات
لتقييم الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة) باستخدام الفلوسيتومتري، يتم استهداف إنزيمات الكاسبيز النشطة داخل الخلايا.
تعتمد هذه الطريقة على تعريض الخلايا لمواد تحتوي على ركائز (Substrates) مخصصة للكاسبيزات، موسومة بصبغات فلورية.
عند تحلل هذه الركائز بواسطة الكاسبيزات النشطة، يتم إطلاق إشارات فلورية يمكن كشفها وتحليلها باستخدام تقنية الفلوسيتومتري.
في بعض أنواع الكيتات التجارية، تُستخدم أيضًا أجسام مضادة موجهة ضد الكاسبيزات النشطة، وموسومة بأصباغ فلورية.
يرتبط وجود هذه الأجسام المضادة بمستوى نشاط الكاسبيز داخل الخلايا، مما يمكّن من:
تحديد الخلايا الخاضعة للاستـماتة بناءً على شدة التلوين الفلوري.
التمييز بين الخلايا السليمة والخلايا التي تمر بمرحلة الاستماتة.
توفر هذه الطرق معلومات إضافية حول مرحلة الاستماتة التي تمر بها الخلايا، سواء كانت في المراحل المبكرة أو المتأخرة من الموت الخلوي المبرمج