الموت الخلوي (الاستماتة)
مقدمة:
يُعد تقييم الموت الخلوي المبرمج (Apoptosis) من التطبيقات المهمة لتقنية الفلوسيتومتري، ويوجد العديد من الطرق المستخدمة لهذا الغرض، حيث يتميز كل منها بمزايا وقيود خاصة.
الطرق الشائعة:
1 - تلوين Annexin V:
تُعد هذه الطريقة من أكثر الأساليب شيوعًا للكشف عن العلامات المبكرة للاستـماتة، حيث تعتمد على رصد الفوسفاتيديل سيرين (Phosphatidylserine)، وهو جزيء دهني ينتقل من الطبقة الداخلية إلى الطبقة الخارجية لغشاء الخلية في المراحل المبكرة من الموت الخلوي المبرمج.
يرتبط بروتين Annexin V الموسوم بصبغة فلورية بجزيئات الفوسفاتيديل سيرين على سطح الخلية.
وباستخدام تلوين مزدوج مع يوديد البروبيديوم (PI)، يمكن التمييز بين:
الخلايا المستميتة (في مرحلة مبكرة): Annexin V إيجابية / PI سالبة.
الخلايا النخرية أو في مراحل متأخرة من الاستماتة: Annexin V إيجابية / PI إيجابية.
.
2 - استخدام أصباغ مرتبطة بالحمض النووي:
تُستخدم أصباغ فلورية مثل Hoechst 33342 أو DAPIفي الكشف عن الخصائص البنيوية للخلايا المستميتة، حيث تساعد على تمييز تكثّف الكروماتين وتجزئة النواة، وهي من السمات المميزة للموت الخلوي المبرمج (الاستماتة).
يمكن تعزيز دقة هذا التحليل بدمج الأصباغ النووية مع اختبارات إضافية، مثل:
قياس نشاط إنزيمات الكاسبيز (Caspase Activity Assays)، والتي تُعد محركًا رئيسيًا لبدء الاستماتة.
تقييم الجهد الغشائي للميتوكوندريا باستخدام أصباغ متخصصة، مما يتيح رصد التغيرات في الطاقة الخلوية التي ترافق عملية الاستماتة.
خصائص الاستماتة :
يُعد تنشيط إنزيمات الكاسبيز (Caspase) من العلامات الحيوية الجوهرية المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج، حيث تلعب هذه الإنزيمات دورًا محوريًا في تنظيم سلسلة من التفاعلات البيوكيميائية التي تنتهي بتفكك الخلية بطريقة منظمة وغير التهابية.
تُتيح تقنية الفلوسيتومتري تقييم نشاط الكاسبيزات على مستوى الخلية المفردة، مما يُوفر أداة دقيقة وكمية لرصد ديناميكيات الاستماتة ومراحلها المختلفة، سواء في الدراسات البحثية أو في التطبيقات السريرية
.
تقييم الاستماتة باستخدام الفلوسيتومتري والكاسبيزات
يُعد تحليل نشاط الكاسبيزات أحد الأساليب الدقيقة لتقييم الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة) باستخدام تقنية الفلوسيتومتري، حيث تُستهدف الإنزيمات النشطة داخل الخلايا للكشف عن تقدم الخلايا في مسار الاستماتة.
تعتمد هذه الطريقة على تعريض الخلايا لمواد تحتوي على ركائز خاصة بإنزيمات الكاسبيز، تكون موسومة بأصباغ فلورية. وعند تحلل هذه الركائز بواسطة الكاسبيزات النشطة، تنبعث إشارات فلورية قابلة للكشف والتحليل عبر جهاز الفلوسيتومتر، مما يتيح قياس مستوى النشاط داخل الخلية.
وفي بعض المجموعات التجارية الجاهزة (kits)، تُستخدم أجسام مضادة موسومة فلوريًا، موجهة خصيصًا للكاسبيزات النشطة، حيث يعكس ارتباطها بالخلايا مستوى النشاط الإنزيمي.
تُتيح هذه الاستراتيجية:
تمييز الخلايا الخاضعة للاستـماتة من خلال شدة الإشارة الفلورية.
التفريق بين الخلايا السليمة وتلك التي تمر بمرحلة مبكرة أو متقدمة من الاستماتة.
بالتالي، توفّر هذه الطرق معلومات كمية ونوعية دقيقة حول مرحلة الموت الخلوي المبرمج التي تمر بها الخلايا، مما يعزز من فهم مسار الاستماتة في السياقات البحثية والسريرية.
من الميتوكوندريا، وهو حدث أولي في مسار cبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الفلوسيتومترية لقياس إطلاق السايتوكروم
الموت الخلوي الذاتي.