قياس السميّة الخلوية (MTT, XTT و DLH)
أنواع اختبارات السميّة الخلوية
اختبار MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
الطريقة:
يعتمد هذا الاختبار على النشاط الإنزيمي للخلايا الحية، حيث تقوم بتحويل مركب MTT إلى شكل ملون يُعرف باسم الفورمازان.
تعتمد كمية الفورمازان المتكونة على عدد الخلايا الحية.
النتائج:
يشير انخفاض امتصاص اللون إلى انخفاض عدد الخلايا الحية، مما يعكس مستوى السمية الخلوية.
توضيح إضافي:
يُستخدم اختبار MTT لتقييم بقاء الخلايا أو لقياس تأثيرات السمية للأدوية أو العوامل الأخرى على الخلايا من خلال التأثير على العمليات الحيوية داخل الخلايا.
يمكن التمييز بين الخلايا الحية والميتة بناءً على نشاطها الأيضي ومعدل تكاثرها وموتها المبرمج، حيث يتأثر التمثيل الغذائي للخلايا تحت تأثير السمية.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعكس بعض الاختبارات باستخدام MTT التغيرات في نمو الخلايا، والانقسام الخلوي، أو القدرة على البقاء، مما يُعد مؤشرًا مبكرًا على الإصابة بالسرطان أو فشل الخلايا في بيئات معينة.
اختبار XTT هو طريقة بديلة تعتمد أيضًا على تحويل أملاح التترازوليوم إلى صبغة ملونة عبر إنزيمات السيتوكروم، ولكن بخلاف MTT، فإن نواتج XTT تذوب مباشرة في الوسط، مما يجعل قراءة الامتصاص أبسط دون الحاجة إلى خطوة إذابة إضافية كما في اختبار MTT
يتم تنفيذ جميع مراحل اختبار MTT بدءًا من زراعة الخلايا وحتى قراءة النتائج باستخدام جهاز الفوتومتر، حيث يتم تفسير البيانات داخل ألواح الميكروتيتر. (Microplate)
يساهم هذا الإجراء الموحد في تعزيز دقة وحساسية الاختبار، كما يزيد من تكرارية النتائج بين التكرارات المختلفة.
يُعد اختبار السمية الخلوية باستخدام MTT من الطرق التقليدية والموثوقة لدراسة تأثير المواد الكيميائية أو المركبات على الخلايا في بيئة .in vitro
في هذا الأسلوب، يتم تعريض الخلايا المزروعة للمواد المختبرة لتقييم مدى تأثيرها السمي.
تشير النتائج عادةً إلى نسبة بقاء الخلايا الحية عند كل تركيز من تركيزات المادة المدروسة.على الرغم من أن اختبار MTT صُمم أساسًا لتقييم المركبات القابلة للذوبان في الماء، إلا أنه يُمكن اليوم تطبيقه على مركبات تذوب في مذيبات عضوية، بل وحتى على النانوذرات.
ولهذا، أصبح هذا الاختبار من أكثر الطرق استخدامًا لتقييم سمّية المواد الجديدة والصيغ الدوائية المختلفة.يمكن استخدام اختبار MTT لدراسة السمية إما على خطوط خلوية مرضية (مثل خطوط الخلايا السرطانية في أبحاث تطوير الأدوية)، أو على خطوط خلوية صحية للتأكد من سلامة المركبات للاستخدام البشري
.
مبدأ عمل اختبار: MTT
اختبار : MTT هو اختبار لوني (كالوريمتري) يعتمد على تقييم النشاط الأيضي للخلايا الحية.
يرتكز مبدأ الاختبار على أن إنزيمات الأكسيدوردوكتاز الخلوية المعتمدة على NADPH أو NADH تقوم باختزال مركب التترازوليوم الأصفر (MTT) إلى بلورات فورمازان أرجوانية غير قابلة للذوبان.الخلايا الحية فقط هي التي تملك القدرة على تنفيذ هذا التفاعل الحيوي.
أما الخلايا الميتة أو المتضررة، فهي تفقد هذه القدرة، وبالتالي لا يتكون الفورمازان بداخلها.
تتم إذابة بلورات الفورمازان الناتجة باستخدام مذيبات مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، مما يتيح قراءة الامتصاص الضوئي باستخدام جهاز قياس الطيف (Spectrophotometer) عند أطوال موجية محددة (عادةً 570 نانومتر).
بالتالي، تكون شدة اللون الأرجواني المتولد متناسبة طرديًا مع عدد الخلايا الحية في العينة المختبرة.
استجابة اختبار السمية الخلوية:
تُعد طريقة MTT واحدة من الطرق الشائعة والسريعة لتقييم سمية المواد، حيث تعتمد على تكوين بلورات الفورمازان ذات اللون الأرجواني نتيجة لاختزال مركب MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) بواسطة إنزيمات الأكسيدوردوكتاز في الخلايا الحية.
يؤدي تفاعل الإنزيمات الحيوية مع مركب التترازوليوم إلى تكوين بلورات الفورمازان داخل الخلية.
كلما زادت كثافة اللون الأرجواني الناتج، دلّ ذلك على نشاط أيضي مرتفع وزيادة في عدد الخلايا الحية.
يُعتبر هذا التفاعل مؤشرًا حيويًا موثوقًا لقياس حيوية الخلايا عبر قياس الامتصاصية الضوئية باستخدام جهاز الفوتومتر عند أطوال موجية محددة.يتم حساب نسبة الخلايا الحية بناءً على المعادلة التالية:
نسبة الخلايا الحية (%) = (متوسط امتصاص العينة المعالجة / متوسط امتصاص العينة المرجعية) × 100
العوامل المؤثرة في نتائج اختبار: MTT
1. وقت المعالجة:
عادةً ما يتم تقييم الخلايا بعد 24، 48، أو 72 ساعة من المعاملة.2. نوع خط الخلايا المستخدم:
سواء خلايا طبيعية أو خلايا سرطانية.3. كثافة الخلايا المزروعة:
حيث تؤثر الكثافة الخلوية على معدل امتصاص اللون ونتائج السمية.4. طريقة إعداد العينات وتعاملها:
مثل دقة إضافة المواد ومزج العينات2. اختبار XTT
(Sodium 3'-[1-(phenylamino)-carbonyl]-3, 4-tetrazolium-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid)
الطريقة:
مشابه لاختبار MTT، مشابهة لاختبار MTT، حيث تعتمد على اختزال الخلايا الحية لمركب XTT إلى منتج ملون قابل للذوبان، ويتناسب مع عدد الخلايا الحية.
النتائج:
زيادة اللون المنتج تعكس ارتفاع عدد الخلايا الحية، في حين أن انخفاض اللون يشير إلى زيادة السمية الخلوية.
اختبار LDH (Lactate Dehydrogenase)
الطريقة: يقيس هذا الاختبار نشاط إنزيم LDH في وسط زراعة الخلايا. عادةً ما يوجد LDH داخل الخلايا، ويتسرب إلى وسط الزراعة عند تلف الغشاء الخلوي.
النتائج: زيادة مستويات LDH في وسط الزراعة تشير إلى تلف الخلايا والسمية.
4. اختبار Trypan Blue Exclusion
الطريقة:
يعتمد اختبار استبعاد تريبان الأزرق على مبدأ تمييز الخلايا الحية عن الميتة عبر صبغة تريبان بلو.
تُضاف الصبغة إلى معلق الخلايا، حيث تخترق أغشية الخلايا التالفة (الميتة) فقط، مما يؤدي إلى تلونها باللون الأزرق، بينما تبقى الخلايا الحية غير ملونة بسبب سلامة غشائها الخلوي.النتائج:
يتم تقييم السمية من خلال عدّ عدد الخلايا المصبوغة (الميتة) ومقارنتها بإجمالي عدد الخلايا في العينة، مما يوفر نسبة تقديرية لبقاء الخلايا الحية.
5 اختبار Comet Assay
الطريقة :
يُعرف اختبار Comet Assay أيضًا باختبار الرحلان الكهربائي للحمض النووي أحادي الخلية (Single Cell Gel Electrophoresis).
تعتمد هذه الطريقة على تقييم تلف الحمض النووي (DNA) داخل الخلايا الفردية.
يتم تعليق الخلايا في طبقة رقيقة من الجل (عادةً من الأجاروز)، ثم تعرض لرحلان كهربائي.
في الخلايا التالفة، تتحرك شظايا الـ DNA بعيدًا عن النواة باتجاه القطب الموجب، مشكّلة نمطًا يشبه الذيل المضيء، وهو ما يشبه "المذنب" تحت المجهر الفلوري
النتائج:
1. يشير طول وكثافة ذيل المذنب إلى مدى تلف الحمض النووي.
2. الخلايا ذات تلف DNA أكبر تُظهر ذيولًا أطول وأكثر كثافة.
3. الخلايا السليمة تُظهر نواة مستديرة بدون ذيل واضح.
يُستخدم اختبار Comet Assay على نطاق واسع لتقييم الأضرار الجينية الناتجة عن العوامل الكيميائية، الإشعاعية، أو البيئية المختلفة
اختبار CellTiter-Glo
الطريقة:
يُستخدم اختبار CellTiter-Glo لقياس مستويات الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) كدليل على حيوية الخلايا.
إنتاج ATP يحدث فقط في الخلايا الحية، مما يجعل تركيزه مؤشرًا مباشرًا على عدد الخلايا النشطة أحيائيًا في العينة.
تعتمد هذه الطريقة على تفاعل إنزيمي يؤدي إلى انبعاث ضوء (Luminescence) يتناسب مع كمية ATP الموجودة.
النتائج:
يشير انخفاض مستويات ATP المقاسة إلى انخفاض عدد الخلايا الحية، مما يعكس ارتفاع السمية الخلوية أو تدهور النشاط الخلوي.
خطوات إجراء اختبارات السمية الخلوية
1. إعداد العينة:
يتم تحضير المادة أو المركب المراد اختباره، ثم يتم تخفيفه إلى تركيزات مختلفة مناسبة للتجربة.
2. زراعة الخلايا:
تُزرع الخلايا الملائمة للاختبار في أوساط زراعية مناسبة تحت ظروف معقمة، ثم تُنقل إلى ألواح الزراعة أو الصحون المختبرية للتحضير للاختبار.
3. تعريض الخلايا للمادة المختبرة:
بعد استقرار الخلايا، يتم تعريضها إلى التركيزات المختلفة من المادة قيد الدراسة لفترة زمنية محددة وفقًا لبروتوكول التجربة.
4. القياس:
عقب فترة الحضانة، يتم إجراء اختبارات السمية الخلوية المختلفة (مثل MTT أو LDH أو Trypan Blue) بهدف تقييم نسبة الخلايا الحية وتقدير مدى الضرر الخلوي.
5. تحليل البيانات:
تُحلل النتائج الناتجة عن الاختبارات إحصائيًا لتحديد تأثير المادة المختبرة على بقاء الخلايا، ولمعرفة وجود أو غياب سمّية خلوية
6. إعداد التقرير:
تُوثق جميع النتائج النهائية ضمن تقرير علمي شامل، يتضمن التحليل الإحصائي للبيانات، وتفسير النتائج، مع تقديم الرسوم البيانية .والجداول التوضيحية المناسبة