يتضمن إجراء الربط استخدام المتجه المُهضَم، الماء، الإنزيم، والمخزن المؤقت المناسب. يختلف إنزيم الربط من بدائيات النوى عن ذلك في حقيقيات النوى في أن العامل المساعد المطلوب لإنزيمات الربط في بدائيات النوى هو ATP، بينما يتطلب إنزيم الربط في حقيقيات النوى NADH. يقوم هذا الإنزيم بتشكيل رابطة فوسفودياستر بين الفوسفات 5' لأحد النيوكليوتيدات والهيدروكسيل 3' لنيوكليوتيد مجاور.
في البداية، يرتبط الإنزيم بالفوسفات غاما لـ ATP من خلال الحمض الأميني أرجينين، مما يؤدي إلى تحرير البي pyrophosphate. بعد ذلك، يهاجم الهيدروكسيل 3' الحر من السلسلة المقابلة الفوسفات، مما يؤدي إلى فصل الفوسفات عن الفوسفات غاما للعامل المساعد وتشكيل رابطة فوسفودياستر جديدة مع الهيدروكسيل 3'. تُجرى معظم التفاعلات في حجم 10 ميكروليتر. بناءً على طول تسلسل الجين المستهدف وطول تسلسل المتجه، يتم خلط كميات محددة وفقًا للصيغة أدناه، ويتم وضعها في تماس مع خليط الإنزيمات لإجراء الربط.
يتم إجراء العملية وفقًا للتعليمات الخاصة بكل إنزيم. تُجرى معظم التفاعلات في حجم 20 ميكروليتر. بناءً على طول تسلسل الجين المستهدف وطول تسلسل المتجه، يتم خلط كميات محددة وفقًا للصيغة الخاصة بالربط، ويتم وضعها في تماس مع خليط الإنزيمات لإجراء الربط.
يعتبر الربط الخطوة الأكثر أهمية في عملية الاستنساخ ويجب أن يتم بدقة، حيث يُستخدم لإدخال جين داخل متجه أو لربط قطع من الحمض النووي.