استخلاص الحمض النووي من العينات البيولوجية

:(DNA) استخراج الحمض النووي

أساس جميع أبحاث البيوتكنولوجيا هو تعديل وتحليل الحمض النووي (DNA) قبل أي تقنيات أخرى، مثل إعداد الحمض النووي (DNA) المؤتلف والاختبارات التشخيصية، يحتاج الباحثون إلى طرق لاستخراج الحمض النووي (DNA) من كائنات مختلفة وتنقيته إلى حد معين. تختلف التقنيات المستخدمة لاستخراج الحمض النووي (DNA) بناءً على مصدر العينة، وحجمها، وعمرها.

نظرًا لتنوع هذه الطرق، هناك نقاط مشتركة بينها، وهي فصل الحمض النووي (DNA) عن بقية مكونات الخلية. يمكن أن يكون الحمض النووي (DNA) كروموسومي، أو بلازميد، أو فيروس بكتيري، ويمكن استخراجه من جميع العينات البيولوجية مثل الأنسجة الحية والمثبتة، والخلايا، وغيرها. يجب أن تتم عملية استخراج الحمض النووي (DNA) بأكثر الطرق لطفًا ممكنة لتجنب إتلاف الحمض النووي (DNA) وكسره إلى قطع أصغر.

تم استخراج الحمض النووي (DNA) لأول مرة في عام 1869 بواسطة فردريش ميسشر، الطبيب السويسري، الذي حاول استخراج الخلايا من العقد اللمفاوية لأبحاثه. ولكن كان من الصعب جدًا الحصول على تركيز مناسب من اللمفاويات، وبالتالي تغيرت الخلايا المستهدفة إلى الكريات البيضاء التي تم الحصول عليها من الصديد المتجمع في الضمادات الجراحية.

في البداية، ركز ميسشر على الأنواع المختلفة من البروتينات التي تشكل الكريات البيضاء. وقد تمكن من إثبات أن البروتينات هي المادة الرئيسية المكونة للسيتوبلازم. أثناء هذه التجارب، لاحظ أنه عند إضافة حمض إلى المحلول، ترسبت مادة، وعند إضافة قاعدة، ذابت مرة أخرى. وبهذه الطريقة، تم الحصول على أول ترسب للملوثات الناتجة عن الحمض النووي. (DNA).

فصل الحمض النووي (DNA)

قام فردريش ميسشر بتصميم بروتوكول جديد لفصل الحمض النووي (DNA) عن البروتينات الموجودة في مستخلصات الخلايا. تم تصميم هذا البروتوكول لفصل النواة عن السيتوبلازم، ثم استخراج الحمض النووي (DNA لم يتمكن البروتوكول الأول من إنتاج كمية كافية من المنتج. وكانت هناك حاجة لبروتوكول ثانٍ لإعداد كميات أكبر من النوكليين النقي، الذي أطلق عليه لاحقًا اسم الحمض النووي النووي بواسطة ريتشارد ألتمن.

بعد ميسشر، تمت جهود أخرى أدت إلى تقدم كبير في عملية استخراج الحمض النووي (DNA). تم تطوير أول العمليات الروتينية المعملية لاستخراج الحمض النووي (DNA) بناءً على استراتيجيات الطرد المركزي المعتمدة على الكثافة. استخدم ميسلسون وستال هذه الطريقة في عام 1958 لشرح عملية النسخ النصف محمي لـ الحمض النووي (DNA).

استفادت العمليات اللاحقة من الاختلافات في ذوبانية الحمض النووي (DNA) الكروموزومي الكبير، والبلازميدات، والبروتينات في العازلات القلوية. والآن، تم إنشاء العديد من الطرق المخصصة لاستخراج الحمض النووي (DNA) النقي، وغالبًا ما تتوفر هذه الطرق على شكل مجموعات تجارية.

التحليل الجيني

يعتبر استخراج الحمض النووي (DNA) للتحليل الجيني لأغراض علمية وطبية وجنائية أمرًا ضروريًا. يستخدم العلماء الحمض النووي (DNA) المستخلص في حالات مثل إدخال الحمض النووي (DNA) غريب إلى خلايا معينة أو في التشخيص في المجال الطبي، تكون هذه العملية ذات قيمة تشخيصية. وفي الأمور الجنائية، يُستخدم الحمض النووي (الحمض النووي (DNA)) المستخلص لتحديد هوية الأفراد. يمكن أن تكون (الحمض النووي (DNA) المستخدمة متنوعة جدًا، ويمكن الحصول عليها من أي كائن حي أو غير حي. تشمل المصادر الشائعة الدم الكامل، الشعر، الحيوانات المنوية، العظام، الأظافر، اللعاب، الخلايا الظهارية، البول، والبكتيريا.

لذا، من الواضح أن كل طريقة لاستخراج الحمض النووي (DNA) يجب أن تتناسب مع العينة المستهدفة بحيث يمكن من خلالها فصل الحمض النووي (DNA) بفعالية عن العينة المعنية. المسألة التالية هي حجم العينة. على سبيل المثال، تختلف طريقة الاستخراج لعينة صغيرة مثل الحيوانات المنوية أو شعرة واحدة عن الطريقة المستخدمة لعدة ملليلترات من الدم.

عامل مهم آخر هو عمر العينة. قد تكون العينة طازجة أو محفوظة. يمكن أن تأتي العينات المحفوظة من الدم أو الأنسجة المجمدة، أو من العظام أو العينات الأثرية من البشر، الحيوانات، والنباتات.

أسهل عملية استخراج هي استخراج الحمض النووي (DNA) من البكتيريا؛ لأن الخلايا البكتيرية لا تحتوي على العديد من التركيبات الهيكلية تحت غشائها الخلوي. تعتبر بكتيريا مثل E. coli الكائنات المختارة لتعديل جميع أنواع الجينات بسبب سهولة عملية استخراج الحمض النووي (DNA) منها. تحتوي E. coli على نوعي الحمض النووي (DNA) الجينومي والبلازميدي، والفرق بينهما هو أن الحمض النووي (DNA) الجينومي أطول بكثير.

تدمير الخلايا

عادةً ما تبدأ عملية استخراج الحمض النووي (DNA) بتمزق أو تفكك الأنسجة والخلايا. لهذا، يجب تدمير الغشاء الخلوي. تعتبر هذه العملية ضرورية لتفكيك البنى البروتينية ولإطلاق الأحماض النووية من النواة. بشكل عام، يتم تمزق العينة في محلول ملحي يحتوي على مواد منظفة وبروتيازات مثل بروتياز K. هذه العملية تؤدي إلى تكسير البنى الخلوية وحل الغشاء. في البكتيريا، يقوم إنزيم يسمى الليزوزيم بهضم البيبتيدوغلكان الذي يشكل التركيب الرئيسي للجدار الخلوي. ثم يقوم منظف مثل سديم دوديسيل سلفات (SDS) بتدمير الغشاء من خلال تعطيل التركيب الدهني ثنائي الطبقة.

في استخراج الحمض النووي (DNA) من الكائنات الأخرى، يعتمد كيفية تدمير الخلايا على تركيبتها. يجب تقسيم العينات النسيجية من الحيوانات والنباتات إلى قطع أصغر لتحرير المركبات داخل الخلايا. يجب أولاً تكسير الخلايا النباتية في خلاط تمامًا، مما يؤدي إلى كسر الجدران الخلوية الصلبة. ثم يتم هضم جدران الأنسجة بمساعدة الإنزيمات، مما يساعد على تحويل البوليمرات الطويلة من اللجنين والسليلوز إلى مونات.

يتم استخراج الحمض النووي (DNA) من الأنسجة الحيوانية مثل أطراف شعر الفأر بعد تكسير الأنسجة بواسطة بروتيناز K وحل الغشاء بواسطة المنظفات. تعتبر الخلايا المزروعة أسهل الخلايا لاستخراج الحمض النووي (DNA) منها، لأنها لا تحتوي على جدار خلوي أو هياكل أخرى خارج غشائها الخلوي. ما يفعله المنظف هو فقط تكسير الغشاء لتحرير المركبات داخل الخلايا. كل كائن حي ونسيج يحتاج إلى إجراء بعض التعديلات الطفيفة في الإجراء لتحرير المركبات داخل الخلايا مثل الحمض النووي (DNA).

تمزق الخلايا

تمزق الخلايا والأنسجة اللينة في استخراج الحمض النووي (DNA) سهل. لكن أحيانًا نحتاج إلى القيام بذلك مع أنسجة صلبة مثل العظام والنباتات الخشبية. يتم تجميد العديد من العينات النباتية الخشبية في النيتروجين السائل وتكسر على الفور إلى مسحوق. تحتوي العظام على العديد من المواد المعدنية ويجب إزالة الأيونات منها قبل الاستخراج حتى لا تتداخل مع العمليات مثل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). بعد إجراء هذه المعالجات على العينة، يجب إجراء عملية التجانس باستخدام الأجهزة المناسبة لجعل الخلط متجانسًا. ثم يتم إجراء عملية التمزق.

بعد تحرير المركبات داخل الخلايا، يجب فصلها عن بقايا الغشاء الخلوي، العظام، الغضاريف، الجدران الخلوية، وغيرها باستخدام الطرد المركزي أو بطرق استخراج كيميائية. يؤدي الطرد المركزي إلى فصل الجسيمات بناءً على حجمها، حيث تترسب الجزيئات الأكبر والأثقل أسرع من الجزيئات الأصغر. بالإضافة إلى ذلك، تشكل المواد غير القابلة للذوبان في المرحلة المائية كتلًا تترسب بسرعة في قاع أنبوب الطرد المركزي. على سبيل المثال، بعد تكسير الجدار الخلوي، تصبح القطع الناتجة أصغر من جزيئات الحمض النووي (DNA). يؤدي الطرد المركزي إلى تجميع جزيئات الحمض النووي (DNA) في كتلة بينما تبقى القطع القابلة للذوبان من الجدار الخلوي في الأنبوب.

فصل قطع الخلايا

طريقة أخرى تستخدم لفصل قطع الخلايا هي الاستخراج الكيميائي باستخدام الفينول. تُستخدم هذه الطريقة لفصل البروتينات غير المرغوب فيها عن الحمض النووي (DNA). الفينول هو حمض يمكنه تدمير 60 إلى 70٪ من الجزيئات البيولوجية بما في ذلك البروتينات. الفينول ليس قابلًا للذوبان في الماء، وبعد مزجه مع عينة مائية تحتوي على الحمض النووي (DNA) وبروتين، يتم فصل طبقتين مختلطتين عن بعضها. يبقى البروتين في الطبقة الفينولية والحمض النووي في الطبقة المائية. يتم فصل الطبقتين بواسطة الطرد المركزي، وبهذه الطريقة يتم فصل الحمض النووي (DNA) الموجود في الطبقة المائية عن الفينول.

بعد فصل جزيئات الحمض النووي (DNA) عن البروتينات، لا تزال العينة تحتوي على نوعي الحمض النووي الحمض النوويالريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA). نظرًا لأن الحمض النووي الريبوزي (RNA) هو أيضًا حمض نووي، فإنه لا يذوب في الفينول. يقوم إنزيم يسمى ريبونوكلياز (RNase) بتحويل الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى ريبونوكليوتيدات. نتيجة لذلك، يتم إنتاج عينة من الحمض النووي (DNA) الموجودة في محلول يحتوي على قطع الحمض النووي الريبوزي (RNA) وريبونوكليوتيدات. عند إضافة حجم متساوٍ من الكحول، يتم فصل قطعة الحمض النووي (DNA) كبيرة جدًا من المرحلة المائية ويتم استخراجها بواسطة الطرد المركزي، بينما تبقى الريبونوكليوتيدات في حالة ذوبان. يمكن استخدام  الحمض النووي (DNA) الناتج في تجارب مختلفة.

البلاسميد

في الهندسة الوراثية، يتم استخراج ثلاثة أنواع من الحمض النووي (DNA) عادة:

الحمض النووي (DNA) الموجود في الخلية (Total DNA)

الحمض النووي (DNA) البلازميد

الحمض النووي (DNA) الفيروس البكتيري

غالبًا ما يُستخدم  الحمض النووي Total DNA  كمصدر لتحضير الجينات لأغراض الاستنساخ، ويشمل الحمض النووي (DNA) الجينومي للكائن الحي وغيرها من جزيئات الحمض النووي (DNA) الموجودة فيه مثل البلازميد. طريقة استخراج الحمض النووي (DNA) البلازميدي نقية مشابهة لطريقة استخراج  الحمض النووي (Total DNA)، مع اختلاف أنه في إحدى المراحل يجب فصل البلازميد عن بقية جزيئات الحمض النووي (DNA).

غالبًا ما يتم استخراج الحمض النووي (DNA) البلازميدات في عمليات البيولوجيا الجزيئية الحديثة عندما تكون مطلوبة كعوامل ناقلة. عادةً ما يتم استخراج الحمض النووي (DNA) البلازميدات من الجسيمات الفيروسية، وليس من خلايا بكتيرية مصابة بالفيروس ومع ذلك، هناك استثناءات في هذه الحالة، يجب استخدام تقنيات خاصة لإزالة الكبسول.