قياس حيويّة الخلايا والعد الخلوي
مقدمة:
تشير حيوية الخلايا إلى تقييم عدد الخلايا السليمة في عينة معينة. يُعد هذا التقييم مؤشرًا جوهريًا لفهم آليات عمل الجينات، والبروتينات، والمسارات المرتبطة بموت الخلية أو تكاثرها.
يُعد عدّ الخلايا وتحديد نسبتها أداة أساسية في تقييم العوامل السامة، إذ يتم تحديد حيوية الخلايا من خلال قياس قدرتها على الانقسام والنمو.
تُستخدم صبغة DAPI، وهي صبغة ترتبط بالحمض النووي DNA داخل الخلايا، لتحديد مورفولوجيا النواة ودراسة دورة حياة الخلايا. يساعد التألق الناتج عن صبغة DAPI في تمييز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة بناءً على شكل نواة الخلية وشدة الإضاءة
سنقوم بعد ذلك بمراجعة الأصباغ المستخدمة بشكل شائع في صبغ عيوشيّة الخلايا.
صبغ العيوشيّة
تُستخدم الأصباغ الحيوية الفلورية في تقييم حيوية الخلايا وتمييز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة في العينة المدروسة.
يعتمد هذا التمييز على سلامة غشاء السيتوبلازم، إذ يسمح الغشاء السليم بانتقاء دخول الجزيئات، بينما تفقد الخلايا الميتة هذه القدرة بسبب تضرر غشائها.
عادةً، يتم إضافة صبغتين فلوريتين مختلفتين إلى العينة:
الصبغة الخضراء مثل(Acridine Orange) :تخترق جميع الخلايا الحية والميتة، وتصطبغ بها أنوية الخلايا السليمة.
الصبغة الحمراء مثل يوديد البروبيديوم Propidium Iodide, PI)): تخترق فقط الخلايا الميتة التي تعرضت أغمادها الخلوية للضرر.
بالتالي:
تظهر الخلايا الحية باللون الأخضر تحت المجهر الفلوري.
تظهر الخلايا الميتة باللون الأحمر نتيجة اختراق صبغة PI لأنويتها.
هذا التفريق يسمح بالتقييم الدقيق لنسبة الخلايا الحية والميتة، ويوفر أداة مهمة في دراسات السمية والبحوث البيولوجية
صبغ الفلورسنت باستخدام : DAPI
تُعد صبغة DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) من أكثر الأصباغ الفلورية استخدامًا لتمييز الخلايا أو البكتيريا في العينات البيولوجية.تعمل DAPI كصبغة فلورية ترتبط بالأحماض النووية، إذ تتفاعل تحديدًا مع الحمض النووي DNA. تمتاز هذه الصبغة بأنها غير قابلة للاختراق عبر أغشية البلازما السليمة للخلايا الحية؛ ولذلك، فهي تُستبعد عادةً من الخلايا التي تحافظ على سلامة أغشيتها.ومع ذلك، يمكن لصبغة DAPI أن تدخل الخلايا التالفة أو الميتة، حيث ترتبط بالـ DNA الموجود داخل النواة أو البكتيريا، مما يجعلها تظهر باللون الأزرق تحت المجهر الفلوري. رغم ذلك، من المهم الإشارة إلى أن DAPI تعتبر صبغة غير انتقائية؛ أي أنها تصبغ جميع الخلايا التي تحتوي على DNA بغض النظر عن كونها حية أو ميتة، كما أنها لا تميز بين أنواع الكائنات الدقيقة المختلفة.
بفضل خصائصها، تُعد DAPI أداة مفيدة عند الحاجة إلى تحديد وجود أو كمية المادة النووية (DNA) في العينات، ولتمييز المكونات الحية عن غير الحية بطريقة غير نوعية.
الأجسام المضادة الفلورية لصبغ العيوشيّة
يمكن استخدام الأجسام المضادة الفلورية كوسيلة لتحديد أو تتبع كائنات محددة ضمن مجموعة ميكروبية معقدة أو متنوعة.
يتم تطوير أجسام مضادة خاصة في المختبر بحيث ترتبط بشكل انتقائي مع كائنات أو خلايا معينة، مما يسمح بالكشف عنها أو مراقبتها باستخدام تقنيات التصوير الفلوري.رغم أن عملية تطوير الأجسام المضادة الخاصة تتطلب وقتًا طويلاً وتكاليف مرتفعة، إلا أنها تمثل أداة فعالة ومهمة في دراسات صبغ العيوشيّة، خصوصًا عندما تكون هناك حاجة للتمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا أو الكائنات الحية الدقيقة ضمن نفس العينة.باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بفلوروفورات، يمكن تحقيق دقة عالية في استهداف الخلايا الحية أو تحديد خصائص معينة للخلايا قيد الدراسة.
بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)
تتضمن هذه الطريقة إدخال جين مشفر لإنتاج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى الجينوم البكتيري أو خلايا الكائنات الحية الأخرى.تُستخدم GFP كأداة قوية لمراقبة حيوية الخلايا وتحديد موقع البروتينات داخل الخلية، حيث يُمكّن الفحص الفلوري من دراسة العمليات الخلوية الحيوية بطريقة مباشرة ودقيقة.
يمكن استخدام الخلايا المعدلة وراثيًا للتعبير عن GFP كوسيلة فعالة لتقييم العيوشيّة ومراقبة نشاط الخلايا تحت المجهر الفلوري.
قيود صبغ الحيوية
تُعد فحوص صبغ الحيوية وسيلة شائعة في المختبر للحصول على تقدير تقريبي لعدد الخلايا الحية أو الميتة في بيئة معينة.
تعتمد هذه الفحوص على صبغات فلورية أو لونية ترتبط بمكونات خلوية محددة، وتُمكّن من تقييم بعض الجوانب الحيوية للخلايا
تشمل بعض القيود الرئيسية ما يلي:
قد يكون من الصعب ملاحظة الخلايا الصغيرة حتى مع استخدام الميكروسكوب. قد تُهمل هذه الخلايا أو تُخفي خلف جزيئات غير حية في العينة.
قد يكون من الصعب تحديد كمية كبيرة من الخلايا، مما يتطلب تخفيف العينة.
قد يكون من الصعب عد الكتل الخلوية أو الخلايا الملتصقة بالأسطح، حيث لا يمكن تمييز الخلايا الفردية عن بعضها البعض في الكتلة الخلوية.
قد يكون من الصعب التمييز بين الخلايا الميتة والمواد غير الحية في العينات الطبيعية الملطخة من أجل البقاء.
لا يمكن لهذه الأصباغ أن تميز بين الأنواع، وبالتالي لا يمكنها قياس تنوع الأنواع في عينة مختلطة.
عد الخلايا
يُعد عدّ الخلايا خطوة أساسية في تجارب زراعة الخلايا. عادةً يتم العد باستخدام المجهر البسيط (غرفة عدّ الخلايا مثل "عدّادة نيوباور").
تُعد هذه الطريقة أساسية لتحديد تركيز الخلايا قبل الزراعة، أو لتقييم نسب النمو أو العيوشيّة، أو لإعداد التجارب الخلوية المختلفة) . تُستخدم هذه الطريقة في العلوم البيولوجية، بما في ذلك التشخيصات الطبية والعلاج. يُعتبر عد الخلايا جزءًا من الفلوسيتومتري وله تطبيقات في المختبرات البحثية والعيادات.
لزرع الخلايا في صفائح متعددة الآبار، وهي عملية تُعرف بالتلقيح أو "seeding"، من الضروري أولاً عد الخلايا المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك، لحساب نسبة القابلية، يلزم العد، وهو ما سنتناوله في هذه المقالة.
تقدم الطريقة التالية إرشادات عامة حول كيفية استخدام غرفة نوبار:
1. يجب أولاً فصل الخلايا الملتصقة باستخدام محاليل مخصصة لفك الروابط الخلوية (مثل التربسين)، ثم إعادة تعليق الخلايا في وسط زراعة مناسب.
2. يتم خلط العينة مع صبغة مثل ترايبان بلو بنسبة 1:1، حيث تسمح الصبغة بتمييز الخلايا الميتة (تصبغ باللون الأزرق) عن الحية (تبقى شفافة).
3. تُملأ غرفة العد بعناية دون فقاعات هوائية.
4. يتم عدّ الخلايا تحت المجهر في مربعات محددة، ويتم حساب تركيز الخلايا باستخدام معادلات العد الخاصة بالغرفة
5. عند عدّ الخلايا، يجب اتباع نظام عدّ منتظم للحفاظ على الدقة، وذلك بالترتيب حتى لا يتم إغفال أي مربع.
بالنسبة للخلايا التي تقع على حدود المربعات، يتم تطبيق قاعدة العد التقليدية:
تُحسب فقط الخلايا التي تلامس الحافتين العلوية واليسرى من المربع، ويتم تجاهل الخلايا الملامسة للحافتين اليمنى والسفلية (إذا بدأ العد من الزاوية العلوية اليسرى للغرفة).
6. بعد الانتهاء من عدّ جميع المربعات المحددة، يتم حساب المتوسط الحسابي لعدد الخلايا.
يُستخدم هذا المتوسط لاحقًا لحساب العدد الكلي للخلايا في العينة، وذلك بناءً على حجم المربع المعروف ومعامل التخفيف المستخدم أثناء التحضير.
حساب تركيز الخلايا
يتم حساب تركيز الخلايا كما يلي:
تركيز الخلايا = متوسط عدد الخلايا في كل مربع × معامل التخفيف × 10⁴
حيث أن معامل 10⁴ يمثل عامل التحويل من حجم الغرفة إلى المليلتر.
يمكن استخدام طريقة أخرى لحساب تركيز الخلايا الحية فقط عند الحاجة إلى التفريق بين الخلايا الحية والميتة، عبر صبغ الخلايا باستخدام صبغات تمييزية (مثل ترايبان بلو).
خطوات العمل:
قم بإعداد محلول 0.4% تريبان بلو في محلول ملحي فسيولوجي متعادل بين 7.2 pH) - 7.3.(
2. امزج 10 ميكروليتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكروليتر من محلول ترايبان بلو 0.4% جديد .اخلط المزيج برفق لتجنب تلف الخلايا
ضع قطرة صغيرة من المزيج على شريحة العد الخاصة (غرفة نيو باور), مما يسمح له بملء المنطقة بالكامل تحت الزجاجة عبر عملية الشعيرية.
ضع غرفة نوبار تحت المجهر المقلوب. كل جانب من الغرفة يتكون من 9 مربعات كبيرة، وقد تختلف طريقة عد الخلايا داخل هذه المربعات. عادةً ما نقوم بعد 4 مربعات في الزوايا، مع التأكد من عدها بالترتيب حتى لا ننسى أي منها. بالنسبة للخلايا الموجودة على حواف المربعات، يتم تطبيق قاعدة تقليدية: احسب فقط الحواف العليا واليسرى (إذا بدأت العد من المربع العلوي الأيسر). قم بعد الخلايا بدقة.
ستكون الخلايا الحية ذات غشاء ملون بسبب تريبان بلو، بينما ستكون الخلايا الميتة إما متكسرًة أو سيكون اللون الأزرق قد تسرب إلى سيتوبلازمها.
عد عدد الخلايا الملونة باللون الأزرق وعدد الخلايا الكلي، واحسب كما يلي:
معامل التخفيف = 2
تركيز الخلايا = متوسط عدد الخلايا في كل مربع × معامل التخفيف × 10^4
نسبة الخلايا الحية = (عدد الخلايا الحية / العدد الكلي للخلايا) × 100
.وبالتالي، باستخدام هذه الطرق، يمكننا حساب عدد الخلايا وقابلية الخلايا