تحليل المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA)

مقدمة:

تعتبر عملية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنتاج و استنساخ الحمض النووي (DNA) متطابقة في جميع عينات الحمض النووي (DNA). وقد تمكن العلم الطبي بفضل تكثير الحمض النووي (DNA) من تقديم تشخيص وعلاج للعديد من الأمراض المستعصية، حيث تُعتبر أمراض السرطان وترميم الأنسجة العظمية من أهم هذه الأمراض.

أنواع ELISA

تعتبر عملية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنتاج و استنساخ الحمض النووي (DNA) متطابقة في جميع عينات الحمض النووي (DNA). وقد تمكن العلم الطبي بفضل تكثير الحمض النووي (DNA) من تقديم تشخيص وعلاج للعديد من الأمراض المستعصية، حيث تُعتبر أمراض السرطان وترميم الأنسجة العظمية من أهم هذه الأمراض.

1- ELISA المباشر:

تم تصميم بروتوكول اختبار ELISA المباشر للكشف عن المولدات المضادة ويتكون من أربع خطوات رئيسية:

1. تغطية اللوحة: يتم أولاً تمديد العينات باستعمال محلول تغطية ثم تُضاف إلى آبار اللوحة. بعد فترة الحضانة، يتم التخلص من المحلول، وتُغسل اللوحة بمحلول. هذا يسمح للبروتينات الموجودة في العينة، بما في ذلك المولد المضاد المستهدف، بالارتباط بسطح اللوحة.

2. تغطية اللوحة: يتم أولاً تمديد العينات باستعمال محلول تغطية ثم تُضاف إلى آبار اللوحة. بعد فترة الحضانة، يتم التخلص من المحلول، وتُغسل اللوحة بمحلول. هذا يسمح للبروتينات الموجودة في العينة، بما في ذلك المولد المضاد المستهدف، بالارتباط بسطح اللوحة.

3. تغطية اللوحة: يتم أولاً تمديد العينات باستعمال محلول تغطية ثم تُضاف إلى آبار اللوحة. بعد فترة الحضانة، يتم التخلص من المحلول، وتُغسل اللوحة بمحلول. هذا يسمح للبروتينات الموجودة في العينة، بما في ذلك المولد المضاد المستهدف، بالارتباط بسطح اللوحة.

4. تغطية اللوحة: يتم أولاً تمديد العينات باستعمال محلول تغطية ثم تُضاف إلى آبار اللوحة. بعد فترة الحضانة، يتم التخلص من المحلول، وتُغسل اللوحة بمحلول. هذا يسمح للبروتينات الموجودة في العينة، بما في ذلك المولد المضاد المستهدف، بالارتباط بسطح اللوحة.

في هذه الطريقة، يتم تثبيت المستضد على الصفيحة الدقيقة، ثم تُضاف أجسام مضادة موسومة محددة لذلك المستضد. غالبًا ما يكون الوسم إنزيمًا ينتج إشارة قابلة للتحديد عند إضافة الركيزة.

المزايا: بسيطة وسريعة في الأداء.

العيوب: حساسية أقل مقارنة بالطرق الأخرى.

2- ELISA غير المباشر:

الفرق الوحيد بين ELISA المباشر وغير المباشر هو أن عملية حضانة الجسم المضاد تُقسم إلى خطوتين. بعد تغطية وحجب اللوحة، تُضاف الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط بالجينات المضادة المستهدفة إلى اللوحة وتُحضن. بعد خطوة الغسل، تُضاف الأجسام المضادة الثانوية الموصولة بالإنزيم—التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ولكن لا ترتبط بالجينات المضادة المستهدفة—إلى اللوحة. بعد حضانة أخرى وغسل الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة، يمكن إجراء خطوة الكشف.

يتضمن ربط المستضد بالصفيحة، ثم إضافة جسم مضاد أولي، يتم الكشف عنه باستعمال جسم مضاد ثانوي موسوم بالإنزيم. هذه الطريقة تعزز الإشارة.

المزايا: حساسية أعلى بفضل استخدام جسم مضاد ثانوي.

العيوب: المزيد من الخطوات وإمكانية حدوث ارتباط غير محدد.

الاختلافات بين اختبارات ELISA المباشر وغير المباشر

• تتمثل ميزة ELISA المباشر في توفير الوقت والمواد، حيث أن بروتوكوله أقصر قليلاً. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقليل خطر التفاعل المتبادل. يحدث التفاعل المتبادل عندما ترتبط الأجسام المضادة بشكل غير محدد بمواقع على جزيئات ليست المولد المضاد المستهدف. وبما أنه ياُستخدم جسم مضاد واحد فقط في ELISA المباشر، فإن هذا الخطر أقل.

• على الرغم من بروتوكول ELISA غير المباشر الأطول وزيادة خطر التلوث المتقاطع، فإنه يقدم أيضًا مزايا كبيرة. على سبيل المثال، توفر هذه الطريقة حساسية أكبر، حيث يمكن أن ترتبط عدة أجسام مضادة ثانوية بجسم مضاد أولي واحد، مما يعزز الإشارة القابلة للكشف.

• علاوة على ذلك، توفر ELISAs غير المباشرة مرونة أكبر. يمكن أن يكون الجسم المضاد الثانوي محددًا لعدة أجسام مضادة أولية، بشرط أن تكون من نفس النوع ومن نوع مضيف مشابه. هذا يعني أن نفس الجسم المضاد الثانوي الموصول يمكن استعماله في تطبيقات مختلفة من ELISA غير المباشر، بينما تحتاج بروتوكولات ELISA المباشرة المختلفة إلى أجسام مضادة أولية موصولة مختلفة.

• ميزة أخرى من ELISAs غير المباشرة هي أنها لا تستطيع فقط الكشف عن المولدات المضادة ولكن يمكنها أيضًا تحديد الأجسام المضادة. لهذا الغرض، يجب طلاء اللوحة بالمولدات المضادة التي ترتبط بالأجسام المضادة المستهدفة، ثم في خطوة الحضانة الأولى، تُضاف العينات بدلاً من الأجسام المضادة الأولية.

3- ELISA الساندويشي:

في طريقة ELISA السندويشي، على عكس الأنواع الأخرى، لا يتم طلاء اللوحة بالجينات المضادة. بدلاً من ذلك، يتم طلاء اللوحة بأجسام مضادة التقاط محددة للجين المستهدف. بعد هذه الخطوة، ياُستخدم محلول خاص يرتبط بالمواقع غير المشغولة من أجسام مضادة الالتقاط لحجب المواقع المتبقية لارتباط البروتينات. ثم تُضاف العينات إلى الآبار. خلال خطوة الحضانة، ترتبط الجينات المضادة المستهدفة بأجسام مضادة الالتقاط، مما يشكل معقداً من الجينات المضادة-الأجسام المضادة.

في الخطوة التالية، تُحضن اللوحة إما مع الأجسام المضادة الموصولة بالإنزيم (التي تُستعمل في ELISA السندويشي المباشر) أو مع الأجسام المضادة الأولية تليها الأجسام المضادة الثانوية الموصولة بالإنزيم (التي تُستعمل في ELISA السندويشي غير المباشر). نقطة هامة في ELISA السندويشي غير المباشر هي أنه يجب أن تكون أجسام مضادة الالتقاط والأولية من أنواع مضيف مختلفة لزيادة خصوصية الاختبار ومنع التداخل غير المحدد.

تتميز هذه الطريقة بدقة وحساسية عالية نظرًا لاستعمال جسمين مضادين يرتبطان بأجزاء مختلفة من إبيتوب الجين المضاد، مما يجعلها ملائمة للعينات المعقدة التي قد تحتوي على جزيئات مشابهة. تتمثل ميزة ELISAs السندويش في خصوصيتها؛ ترتبط الأجسام المضادة التي تعترف بالمولد المضاد بإبيتوبات مختلفة، مما يجعل من شبه المستحيل أن ترتبط كلتا الأجسام المضادة بشكل غير محدد. لذلك، تُعتبر ELISAs السندويش طريقة ملائمة للعينات المعقدة.

من عيوب ELISAs السندويش أنه في بعض الأحيان قد يكون من الصعب العثور على جسمين مضادين يعملان بشكل جيد معًا بينما لا يزالان يرتبطان بإبيتوبات مختلفة من نفس المولد المضاد.

تستخدم هذه الطريقة جسمين مضادين: جسم مضاد لالتقاط المستضد وآخر للكشف يرتبط بموقع مختلف على نفس المستضد. هذه الصيغة مفيدة بشكل خاص لتحديد الجزيئات الكبيرة.

مبادئ الإليزا الساندويش

اسم "الإليزا الساندويش" يصف بشكل دقيق خطوات الإجراء المعنية. تستند هذه الطريقة إلى إنشاء "ساندويش" من الجينات المضادة والأجسام المضادة. في هذه التقنية، تعمل الأجسام المضادة الأولية كـ "خبز"، بينما تعمل الجينات المضادة كـ "حشوة". وأخيرًا، يتم إضافة جسم مضاد ثانوي مرتبط بإنزيم إلى الساندويتش، وفي وجود ركيزة، يحدث تفاعل إنزيمي ينتج عنه إشارة قابلة للتحديد.

الخطوات العامة للإليزا الساندويش هي كما يلي:

1. تغطية اللوحة بالجسم المضاد الأولي: في البداية، يتم تغطية سطح لوحة ميكروتيتر (عادةً من بوليسترين) بأجسام مضادة محددة ترتبط بالجين المضاد المستهدف.

2. إضافة العينة: بعد ذلك، تُضاف عينة تحتوي على الجين المضاد إلى الآبار. إذا كان الأنتيجين المستهدف موجودًا في العينة، فسوف يرتبط بالأجسام المضادة المطلية.

3. الغسل: بعد ارتباط الجين المضاد بالجسم المضاد الأولي، يتم غسل الآبار لإزالة الجين المضاد غير المرتبطة والمواد الزائدة الأخرى.

4. إضافة الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم: يتم إضافة جسم مضاد ثانوي مرتبط بإنزيم، مثل بيروكسيداز الفجل (HRP) أو الفوسفاتاز القلوي (AP)، إلى الآبار. هذا الجسم المضاد سيرتبط بمنطقة أخرى من الجين المضاد.

5. الغسل: يتم غسل الآبار مرة أخرى لإزالة أي أجسام مضادة ثانوية غير مرتبطة.

6. إضافة الركيزة: تُضاف ركيزة محددة يتم تحللها بواسطة الإنزيم إلى الآبار. يؤدي التفاعل الإنزيمي مع الركيزة إلى إنتاج إشارة لونية أو فلورسنت.

7. تحديد الإشارة: يتم تحديد شدة الإشارة الناتجة، والتي عادةً ما تُقاس باستعمال مطياف الامتصاص أو الفلورية، وهي تتناسب مع كمية الجين المضاد الموجود في العينة.

خطوات تنفيذ الإليزا الساندويش

يتضمن تنفيذ تقنية الإليزا الساندويش عدة خطوات حساسة، كل منها يتطلب دقة واتباع ظروف محددة:

• تحضير لوحة الميكروتيتر: في هذه المرحلة، يتم تغطية لوحات الميكروتيتر بالأجسام المضادة الأولية. يجب اختيار هذه الأجسام المضادة بحيث ترتبط بشكل خاص وفعال بالأنتيجين المستهدف.

• حجب اللوحة: بعد تغطية اللوحة بالجسم المضاد، يجب تغطية سطح الآبار باستعمال محلول حجب (مثل BSA أو الكازين) لمنع الارتباط غير المحدد للعينة أو الأجسام المضادة الأخرى بسطح اللوحة.

• إضافة العينة والت incubate: في هذه المرحلة، تُضاف عينات تحتوي على الأنتيجين إلى الآبار، وتُخزن اللوحات لمدة زمنية محددة. يعتمد هذا الوقت على نوع الجين المضاد والجسم المضاد، وقد يتراوح بين ساعة إلى ساعتين أو أكثر.

• الغسل: تساعد الغسلات المتكررة باستخدام محاليل الغسل في إزالة المواد غير المرتبطة وتمنع فقدان دقة النتائج.

• إضافة الجسم المضاد الثانوي: بعد الغسل، يتم إضافة الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم إلى الآبار. يجب أن يرتبط هذا الجسم المضاد بإيبيتوبي مختلف عن الإيبيتوبي الذي ارتبط به الجسم المضاد الأولي لإكمال الساندويتش.

• الغسل وإضافة الركيزة: بعد ارتباط الجسم المضاد الثانوي، يتم غسل الآبار مرة أخرى، ثم تُضاف الركيزة الإنزيمية. يؤدي التفاعل الإنزيمي مع الركيزة إلى إنتاج لون أو فلوريسنس يمكن قياسه.

• قياس وتحليل النتائج: أخيرًا، يتم قياس الإشارة الناتجة باستخدام مطياف الامتصاص أو الفلورية. تتناسب الإشارة الناتجة مع تركيز الجين المضاد في العينة، وبناءً على منحنى القياس القياسي، يمكن تحديد تركيز الجين المضاد في العينات.

تطبيقات تقنية الإليزا الساندويش

تُستخدم تقنية الإليزا الساندويش في العديد من المجالات البحثية والتشخيصية بفضل دقتها العالية وحساسيتها. بعض التطبيقات المهمة لهذه التقنية تشمل:

1. تشخيص الأمراض: تُستعمل الإليزا الساندويش لتشخيص مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية. تُعتبر هذه التقنية فعالة بشكل خاص في تشخيص الأمراض المعدية مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV)، والتهاب الكبد، وCOVID-19.

2. تحديد مستويات الهرمونات: يمكن استعمال هذه التقنية لتحديد مستويات الهرمونات بدقة في الدم أو سوائل الجسم الأخرى، وهو أمر مهم في الأبحاث المتعلقة بالاضطرابات الغددية وتقييم الصحة العامة.

3. تحديد البروتينات الخاصة: في أبحاث البيولوجيا الجزيئية، يمكن استعمال الإليزا الساندويتش لتحديد وتحديد البروتينات الخاصة في عينات معقدة مثل المصل أو الأنسجة. هذه الأبحاث مهمة بشكل خاص في دراسات البروتيوميات وأبحاث السرطان.

4. مراقبة الاستجابات المناعية: في مجال المناعة، يمكن استعمال الإليزا الساندويتش لمراقبة الاستجابات المناعية للتطعيمات أو لدراسة إنتاج الأجسام المضادة استجابةً للعدوى.

5. تحليل الأدوية: تُستعمل هذه التقنية أيضًا في عمليات تطوير الأدوية لتحليل ودراسة تأثير الأدوية على إنتاج أو تثبيط الأنتيجينات. يمكن أن تكون الإليزا الساندويتش أداة فعالة في تقييم فعالية الأدوية في نماذج الأمراض المختلفة.

مزايا تقنية الإليزا الساندويش

توفر استخدام الإليزا الساندويش عدة مزايا مقارنة بأساليب التشخيص والبحث الأخرى:

• دقة وحساسية عالية : بفضل استخدام جسمين مضادين مختلفين، يرتبط كل منهما بإيبيتوبي مختلف من الجينات المضادة، تتمتع هذه التقنية بدقة وحساسية عالية.

• القدرة على كشف الجينات المضادة في تركيزات منخفضة : يمكن للإليزا الساندويش التعرف على الأنتيجينات الموجودة في تركيزات منخفضة جدًا وقياسها.

• إمكانية التنفيذ على عينات معقدة : يمكن تطبيق هذه الطريقة على عينات معقدة مثل المصل، والبلازما، وسوائل الجسم دون الحاجة للتنقية المسبقة.

قيود تقنية الإليزا الساندويتش

على الرغم من مزاياها العديدة، فإن الإليزا الساندويش لها أيضًا قيود:

• احتمالية حدوث تفاعلات متقاطعة : قد يؤدي استخدام جسمين مضادين مختلفين إلى حدوث تفاعلات متقاطعة ونتائج خاطئة.

• الحاجة إلى أجسام مضادة عالية الجودة : تعتمد دقة وحساسية تقنية الإليزا الساندويش على جودة الأجسام المضادة المستخدمة.

• الوقت المستغرق في المراحل التنفيذية : يتطلب تنفيذ هذه التقنية بالكامل وقتًا ودقة كبيرة، مما قد يتسبب في تحديات لبعض التطبيقات.

4- ELISA التنافسي:

في ELISA التنافسي المعروف أيضًا باسم ELISA المثبط)، تكون كمية الجزيئات الموصولة محدودة، وتتنافس الجينات المضادة أو الأجسام المضادة الموجودة في العينة مع الجينات المضادة أو الأجسام المضادة المرجعية للارتباط بهذه الجزيئات الموصولة. بعبارة أخرى، تقيس هذه الطريقة بشكل غير مباشر مقدار التفكيك من خلال تحديد تداخل الإشارة.

يمكن تعديل جميع أنواع ELISA، بما في ذلك المباشر وغير المباشر والسندويشي، إلى هذا الشكل التنافسي. ومع ذلك، قد تختلف البروتوكولات والمواد في ELISA التنافسي عن الأنواع الأخرى.

بروتوكول ELISA التنافسي المباشر

لإجراء ELISA تنافسي مباشر، يمكن اتباع الخطوات التالية:

• تغطية اللوحة: قم بطلاء اللوحة بالمولد المرجعي، ثم احجب المواقع المتبقية لارتباط الأجسام المضادة باستخدام محلول مناسب.

• حضانة العينة: يتم حضانة العينة التي تحتوي على تركيز غير معروف من الجينات المضادة مع كمية محدودة من الأجسام المضادة الموصولة. إذا كانت تركيز المولدات المضادة في العينة منخفضة، فلن تتمكن العديد من الأجسام المضادة من الارتباط بالمولد المضاد في العينة، والعكس صحيح.

• نقل الخليط إلى اللوحة: يتم نقل خليط الأجسام المضادة الموصولة والعينة إلى الآبار المطلية بالمولد المرجعي. في هذه المرحلة، سترتبط الأجسام المضادة التي لم تتمكن من الارتباط بمولدات العينة بالمولد المرجعي.

• غسل اللوحة: تُغسل اللوحة لإزالة الأجسام المضادة المرتبطة بمولدات العينة التي لم تثبت على اللوحة.

• الكشف والقياس: يُضاف محلول ركيزة محدد إلى اللوحة، ويتم قياس تغير اللون الناتج. كلما زاد تغير اللون، كان ذلك دليلًا على وجود كمية أقل من المولد المضاد في العينة، والعكس صحيح.

مزايا وعيوب ELISA التنافسي

تعتمد مزايا وعيوب ELISA التنافسي على النوع الأساسي المختار للتجربة (مباشر، غير مباشر، أو سندويشي). تعتبر هذه النوع من ELISA مفيدة بشكل خاص عندما تكون مقدارات التفكيكات في العينات متدنية جدًا أو عندما تكون الجينات المضادة أو الأجسام المضادة متشابهة للغاية ويكون التعرف الدقيق عليها بدون تنافس مستحيل.

المزايا: يمكن أن تكون هذه الطريقة فعالة جدًا في قياس تركيزات التحليل في عينات معقدة، خاصة عندما يتم قياس التحليلات بشكل تنافسي وفي وجود أجسام مضادة موصولة محدودة، مما يؤدي إلى حساسية عالية.

العيوب: قد يكون لهذه الطريقة دقة أقل مقارنةً بالأنواع الأخرى من ELISA بسبب التنافس بين التحليلات والأجسام المضادة الموصولة للارتباط بالمولد المرجعي. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بروتوكولاتها أكثر تعقيدًا من الأنواع الأخرى من ELISA وتحتاج إلى مزيد من التحكم الدقيق في الخطوات.

ELISA الكمي:

تم تصميم ELISA الكمي لقياس تركيز مادة معينة في العينة، غالبًا باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه من تركيزات معروفة من المستضد المستهدف.

المزايا: يوفر قياسات دقيقة للتركيز.

العيوب: يتطلب معايرة وتوحيدًا دقيقين.

ELISA شبه الكمي:

يوفر هذا النوع مقياسًا نسبيًا لتركيز المادة، غالبًا ما يصنف النتائج على أنها إيجابية أو سلبية أو إيجابية بشكل ضعيف.

المزايا: أسهل في التفسير من النتائج الكمية.

العيوب: أقل دقة من الاختبارات الكمية.

ELISA متعدد التحليل:

هذه النسخة المتقدمة تسمح بالكشف المتزامن عن عدة مواد تحليلية في عينة واحدة باستخدام أجسام مضادة مختلفة مرتبطة بعلامات مميزة.

المزايا: يوفر الوقت وحجم العينة، ويسمح بتحليل شامل.

العيوب: أكثر تعقيدًا ويتطلب معدات متطورة.

كل نوع من ELISA له مزاياه وعيوبه الخاصة، واختيار النوع المناسب يعتمد على المتطلبات المحددة للدراسة، مثل طبيعة العينة، المادة المستهدفة، والحساسية والدقة المطلوبة.

كيفية تحليل نتائج ELISA

بعد مراجعة مبادئ تشغيل الأنواع المختلفة من ELISA، حان الوقت الآن للحديث عن تحليل البيانات. يمكن أن توفر ELISAs نتائج متنوعة، والتي يمكن تصنيفها عمومًا إلى ثلاثة أنواع:

1- المعطيات النوعية:

في هذه الحالة، الهدف هو فقط تحديد وجود أو عدم وجود مولد مضاد أو جسم مضاد في العينة. بعبارة أخرى، تجيب هذه النوع من المعطيات على سؤال ما إذا كان المولد المضاد أو الجسم المضاد موجودًا في العينة. هذه المعطيات مفيدة للتطبيقات الأولية مثل الفحوصات الأولية أو تأكيد وجود عامل معين.

2- المعطيات شبه الكمية:

في هذه النوع من المعطيات، لا تريد معرفة المقدار الدقيق للمولد المضاد أو الجسم المضاد؛ بل تريد إجراء مقارنة بين مقدارات هذه الجزيئات في عينات مختلفة. على سبيل المثال، يمكنك تحديد ما إذا كان مقدار المولد المضاد أو الجسم المضاد في العينة A أكبر أو أقل من العينة B.

3- المعطيات الكمية:

في هذا النوع، الهدف هو تحديد المقدار الدقيق للمستضد أو الأجسام المضادة في العينة. هذه المعطيات مفيدة جداً للدراسات الأكثر تفصيلاً، مثل تحليل التغيرات في مستويات المستضد أو الأجسام المضادة بمرور الوقت أو استجابةً للعلاج.

أهمية الضوابط في تحليل البيانات

للحصول على نتائج موثوقة ودقيقة في اختبارات ELISA، من الضروري تضمين كل من الضوابط السلبية والإيجابية في كل لوحة ELISA.

• التحكم السلبي: تساعد هذه الضوابط في تحديد وتصحيح المعطيات الإيجابية الكاذبة الناتجة عن الارتباط غير المحدد أو التلوث. عادةً ما يتضمن التحكم السلبي عينة لا تحتوي على المستضد أو الجسم المضاد المستهدف.

• التحكم الإيجابي: تم تصميم هذه الضوابط لتأكيد الوظيفة الصحيحة للاختبار. إذا تم إجراء الاختبار بشكل صحيح، يجب الحصول على نتائج إيجابية من الضوابط الإيجابية، حتى لو كانت جميع العينات سلبية.

  

المواد الكيميائية المطلوبة لاختبارات ELISA

تعتمد المواد الكيميائية اللازمة لاختبار ELISA على البروتوكول المستخدم، ولكنها تشمل عادةً: محاليل الطلاء، والحجب، والغسل، والأجسام المضادة أو المستضدات المعلمة بالإنزيم، والركيزة، وحل التوقف. لتحديد المستضدات والأجسام المضادة الشائعة، يمكنك عادةً شراء مجموعات ELISA جاهزة للاستعمال تتضمن جميع المواد اللازمة.

تشمل المواد الكيميائية الشائعة في هذه المجموعات:

·       محلول الطلاء: أكثر محاليل الطلاء شيوعًا هما PBS (محلول ملحي مُخفف بالفوسفات) وكربونات الصوديوم. تعمل هذه المحاليل على تثبيت المستضد أو الجسم المضاد المستخدم لطلاء اللوحة أثناء الحضانة.

·       محلول الحجب: لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الكاشفة بسطح اللوحة، يجب حجب المواقع المتبقية لارتباط البروتين. ويتم ذلك باستعمال بروتينات الحجب مثل الألبومين البقري (BSA)، أو حليب جاف خالي من الدسم (NFDM)، أو الكازين أو الكازينات، أو المصل العادي، أو جيلاتين السمك.

·       محلول الغسل: تُجرى خطوات الغسل لإزالة المواد غير المرتبطة عادةً باستعمال PBS يحتوي على كمية صغيرة من مادة منظفة غير أيونية مثل Tween® 20.

·       الأجسام المضادة أو المستضدات المعلمة بالإنزيم: تعتمد الأجسام المضادة أو المستضدات المطلوبة على نوع التفكيك. لتعليم الأجسام المضادة أو المستضدات بإنزيم، تُستعمل عادةً أنظمة ستربتافيدين-بيوتين لربط الأجسام المضادة أو المستضدات بالإنزيم الكاشف. الأنزيمان الشائعان المستخدمان لهذا الغرض هما إنزيم بيروكسي داز الفجل (HRP) والفوسفاتاز القلوي (ALP).

·       ركيزة الإنزيم وحل التوقف: تم تصميم الركائز وحلول التوقف خصيصًا لكل إنزيم.

·       ركيزة :HRP تحتوي ركيزة HRP على TMB (ثلاثي ميثيل البنزيدين)، محلول ركيزة محدد، وبيروكسيد الهيدروجين. يمكن إيقاف التفاعل باستعمال حمض الكبريتيك.

·       ركيزة :ALP تحتوي ركيزة ALP على محلول p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP)، ويمكن إيقاف التفاعل باستعمال ( (NaOH )هيدروكسيد الصوديوم.

المعدات المطلوبة لاختبار ELISA

لإجراء اختبار ELISA، ستحتاج إلى المعدات التالية:

1. ماصات: لإضافة المواد الكيميائية والعينات إلى آبار الميكروبيوت.

2. حاضنة: للحفاظ على اللوحة عند درجة حرارة ثابتة.

3. غسالة اللوحات: لإزالة الجزيئات غير المرتبطة.

4. قارئ اللوحات: لتفكيك نتائج الاختبار.

5. طرد مركزي: لفصل الجزيئات.

إذا كنت تعمل في مختبر بميزانية محدودة أو قدرة متدنية، قد لا يتوفر جهاز غسل. في هذه الحالة، يمكنك استعمال الماصات جنبًا إلى جنب مع نظام شفط لأداء خطوات الغسل.

من ناحية أخرى، قد تبحث المختبرات ذات السعة العالية عن حلول لزيادة كفاءتها. في هذه الحالة، يمكن أن يكون استعمال أنواع مختلفة من الماصات مفيدًا، بما في ذلك:

• ماصات ذات رأس قابل للتعديل: لنقل العينات بين تنسيقات حاويات مختبر مختلفة.

• ماصات 96 قناة: لإضافة المواد الكيميائية في وقت واحد إلى كل بئر.

• روبوتات ماصّة صغيرة على الطاولة: لأتمتة العملية.