القطع الإنزيمي
مقدمة
تُعد عملية الهضم الإنزيمي واحدة من المراحل الأساسية في الهندسة الوراثية، حيث تُستخدم الإنزيمات المحددة. تقوم الإنزيمات المحددة بقطع تسلسلات معينة من الحمض النووي (DNA) مزدوج الشريط. يمكن استخدام التقنية التالية لتسهيل نقل أي قطعة من الحمض النووي، وذلك عندما تكون مواقع قطع الإنزيمات محيطة بالجين المطلوب، مما يسمح بإنشاء تسلسلات مكملة في مواقع مناسبة داخل المتجه (الناقل) لتمكين إدخال الجين في البلازميد.
تُعرف الإنزيمات المحددة (إنزيمات القطع المحددة) بأنها بروتينات تقوم بقطع الحمض النووي عند (أو بالقرب من) مواقع معينة للتعرف (يرجى الرجوع إلى كتالوجات الشركات المصنعة أو قواعد بيانات إنزيمات القطع المحددة). هناك نوعان من إنزيمات القطع المحددة تعمل بشكل مختلف في كيفية قطع الحمض النووي المستهدف:
القطع بإنشاء نهايات مستقيمة: تقوم هذه الإنزيمات بقطع كلا خيطي الحمض النووي المستهدف في نفس النقطة، مما ينتج نهايات مستقيمة.
القطع بإنشاء نهايات لزجة: تقوم هذه الإنزيمات بقطع كلا خيطي الحمض النووي المستهدف في مواقع مختلفة، مما ينتج نهايات حرة من 3′ أو 5′، عادةً من 1 إلى 4 نوكليوتيدات طويلة (تُعرف بالنهايات اللزجة).
لكي يتم استنساخ أو التعبير عن تسلسل DNA محدد في متجه، يجب أن يتم هضمهما بواسطة إنزيمين محددين ينتجان نهايات مكملة. يجب أن ينتج على الأقل أحد الإنزيمات المحددة المستخدمة نهاية لزجة لضمان توجيه الجين بشكل صحيح.
تُعد عملية الاستنساخ باستخدام الهضم الأنزيمي تقنية شائعة في المختبر. لأغراض هذه الدورة التعليمية، سنناقش كيفية نقل cDNA من بلازميد إلى آخر. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة أيضًا لنقل المحفزات، والعلامات، أو أي تسلسلات DNA أخرى بين البلازميدات.
لنفرض أنك تبدأ مشروعًا جديدًا يتعلق بجينك المفضل (YGOI). قد تحتاج إلى استنساخ YGOI في خلايا ثديية. التحدي هو أن النسخة الوحيدة الكاملة من cDNA (المُصنَّعة من تسلسل mRNA) المتاحة لـ YGOI هي في متجه تعبيري بكتيري. باستخدام عملية الاستنساخ، يمكنك بسهولة نقل YGOI إلى متجه تعبيري ثديي.
يتم قطع الجين المطلوب من كلا الجانبين بواسطة إنزيمين، ويتم هضم البلازميد بشكل منفصل بنفس الإنزيمات المحددة. وبهذا الشكل، تُنشئ النهايات اللزجة المكملة في البلازميد والجين المستهدف، مما يسمح بربطهما معًا.
التصميم (اختيار الإنزيمات المحددة)
تتيح لك العديد من أدوات تحليل الحمض النووي، بما في ذلك موقع Addgene، تحديد مواقع قطع الإنزيمات المحددة ضمن تسلسل معين. عند اختيار الإنزيمات المحددة، اختر تلك التي:
تقطع كلا طرفي الجين المستهدف دون ترك موقع قطع في المنتصف.
تكون مواقع قطعها في المكان المطلوب في البلازميد، ويفضل أن تكون في موقع الاستنساخ المتعدد (MCS)، دون أن تقطع في أي مكان آخر بالبلازميد.
تؤدي إلى وضع الجين الخاص بك في البلازميد المستقبِل (كن حذرًا، فلا تريد التعبير عن النسخة المضادة للجين الخاص بك!).
تكون مواقع قطعها في موقع مناسب بالنسبة للجينات المستهدفة لاختيار المستعمرات الحاملة للبلازميد والمستعمرات الحاملة للبلازميد المُركب (سننشر مقالاً حول اختيار المستعمرات في المستقبل).
من المثالي أن تجد إنزيمين محددين مختلفين لعملية الاستنساخ الخاصة بك. يمكن أيضًا استخدام إنزيم واحد، ولكن في هذه الحالة، ستحتاج إلى معالجة البلازميد المستقبِل بالفوسفاتاز وستحتاج أيضًا إلى اختبار هضم إنزيمي معين لتأكيد صحة عملية الاستنساخ.
إذا لم تتمكن من العثور على إنزيمات محددة تتوافق مع هذه المعايير، فلا داعي للقلق. لديك خيارات أخرى، مثل:
إضافة تسلسل إنزيم محدد مرغوب به إلى طرفي الجين المطلوب : يمكنك استخدام الاستنساخ القائم على PCR لإضافة تسلسل قطع الإنزيم المحدد إلى نهايات أوليغوكليداتك. سيتيح لك ذلك إنتاج نسخة من الجين المطلوب بجانب مواقع قطع الإنزيم المحدد المتوافقة مع MCS البلازميد المستقبِل. ومع ذلك، يجب عليك تجنب الإنزيمات المحددة التي تقطع داخل تسلسل الجين المطلوب.
إضافة تسلسل إنزيم محدد مرغوب به إلى البلازميد المستقبِل : يمكنك تعديل MCS البلازميد المستقبِل باستخدام تقنية Annealed-oligo Cloning الاستنساخ بالأولغو الملتحمة.
يتم فصل الجين المطلوب من البلازميد المانح بواسطة إنزيمين مختلفين. يتم هضم البلازميد بنفس الإنزيمين. وهذا يؤدي إلى إنشاء تسلسلات مكملة تجعل الجين المطلوب يوضع بشكل صحيح داخل البلازميد المستقبِل.
إذا كنت محظوظًا بما يكفي لوجود خيارات متنوعة للإنزيمات المحددة المناسبة لجينك المستهدف وتؤدي إلى الاتجاه الصحيح في البلازميد المستقبِل، فمن الجيد أن تتحقق مما إذا كانت مجموعة من الإنزيمات تعمل في نفس محلول إنزيم القطع المحدد (للحصول على مزيد من المعلومات حول محاليل إنزيمات القطع المحددة، يرجى الرجوع إلى New England Biolabs). إذا اخترت إنزيمات يمكن أن تعمل في محلول واحد، فسيتم توفير وقتك في المراحل اللاحقة.
اختر إنزيمات محددة لكل من البلازميد المانح والمستقبِل. نظرًا لأنك ستفقد بعض الحمض النووي أثناء خطوة تنقية الجل (بعد عزل البلازميد)، من المهم هضم كمية كبيرة من البلازميدات. نوصي باستخدام 1.5-2 ميكروجرام من البلازميد المانح و1 ميكروجرام من البلازميد المستقبِل. كما أنه من المهم جدًا التأكد من أن البلازميد المستقبِل يتم هضمه بواسطة كلا الإنزيمين قدر الإمكان.
إذا كنت ستستخدم فقط إنزيمًا محددًا واحدًا أو إنزيمات محددة ستنتج نهايات لزجة مكملة أو لا نهايات حرة بعد الهضم، يجب عليك استخدام الفوسفاتاز لمنع إعادة ربط البلازميد المستقبِل. اعتمادًا على الفوسفاتاز الذي تختاره، يجب معالجة البلازميد المستقبِل المُهضم بالفوسفاتاز إما قبل خطوة الربط أو قبل خطوة تنقية الجل. عادةً ما يُستخدم CIP (فوسفاتاز الأمعاء البقرية) أو SAP (فوسفاتاز القريدس القلوي).