الحمض النووي (DNA) المتمم

لدراسة كمية تعبير الجينات، يجب أولاً استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا، ثم يتم بناء cDNA أو  DNA المكمل باستخدام إنزيم النسخ العكسي أو . Reverse Transcriptase إنزيم النسخ العكسي هو الإنزيم الذي يمكنه تصنيع جزيئات الحمض النووي (DNA) من الحمض النووي الريبوزي.  (RNA) جزيء cDNA هو سلسلة من جزيء الحمض النووي (DNA) يتم الحصول عليها من mالحمض النووي الريبوزي mRNA الناضج. (cDNA) يمكن إجراء تحليل كمي لمستوى تعبير الجين المطلوب من خلال تقنية Real-Time تفاعل البلمرة المتسلسل . (PCR)

يمكن استخدام أنواع مختلفة من البرايمرات في إنتاج جزيء الحمض النووي cDNA ، مثل: oligo-dT، البرايمرات المتخصصة، والهكسامرات العشوائية. تُستخدم برايمر oligo-dT لإنتاج الحمض النووي (DNA) المكمل من. mRNA حيث إن oligo-dT يكمل نهايات خيوط mRNA الغنية بالتيميدين، ويرتبط بالجزء النهائي لها. يمكن استخدام الهكسامرات العشوائية في تصنيع الحمض النووي (DNA) المكمل من أنواع أخرى من الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص، حيث إن ارتباطها بأجزاء مختلفة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) يكون عشوائيًا. وعندما نرغب في استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) مثل microRNA ، يتم استخدام البرايمرات المتخصصة.

تظهر مراحل تصنيع الحمض النووي cDNA كما يلي:

تُنقل العينات المحتوية على الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى أنابيب. يجب أن تكون المادة المذابة التي يتم فيها حل الحمض النووي الريبوزي (RNA) خالية من الحمض النووي الريبوزي (RNA)ase. بعد ذلك، تُضاف البرايمرات إلى الأنابيب.

في المرحلة التالية، يجب وضع العينات في أجهزة السايكل الحراري لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، حيث تنفصل خيوط الحمض النووي الريبوزي (RNA) تمامًا. ثم تُوضع العينات لفترة قصيرة على الثلج. يجب إضافة كمية محددة من المسترميكس إلى كل أنبوب، وأخيرًا تُخضع العينات لدورات حرارية. في الدورة الأولى، عند درجة حرارة 55 درجة، تتصل البرايمرات ثم يتم إضافة الإنزيمات وتبدأ عملية التصنيع. في الدورة الثانية، عند درجة حرارة 85 درجة مئوية، يتم تعطيل الإنزيمات، وفي الدورة الثالثة، تُبرد العينات. ثم تُنقل العينات إلى درجة حرارة -20 درجة مئوية للتخزين.