اختبار الإليزا (ELISA) هو طريقة واسعة الاستعمال للتعرف على البروتينات والأجسام المضادة وغيرها من الجزيئات الحيوية وتحديدها. الإليزا الخلوية هي نسخة متخصصة من هذه التقنية تقيس تعبير البروتين أو التعديلات بعد الترجمة مباشرة في الخلايا المزروعة، مما يلغي الحاجة إلى تحلل الخلايا في بعض البروتوكولات. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة مسارات الإشارة، إفراز السيتوكينات، وتنشيط المستقبلات بطريقة عالية الإنتاجية.
تعمل الإليزا الخلوية بطريقة مشابهة للإليزا التقليدية ولكن يتم تنفيذها على خلايا سليمة أو مثبتة في أطباق ميكروتيتر. تشمل الخطوات العامة:
· زراعة الخلايا ومعالجتها – تُزرع الخلايا في أطباق تحتوي على 96 أو 384 بئرًا وتُعالج بمؤثرات مثل الأدوية أو السيتوكينات.
· التثبيت والاختراق – يتم تثبيت الخلايا مثل باستعمال الفورمالديهايد) وقد يتم اختراقها إذا لزم الأمر (للهدفات داخل الخلوية.
· الحجب – يتم حجب مواقع الربط غير المحددة بمواد مثل BSA أو حليب جاف خالي من الدهون.
· الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية – يرتبط جسم مضاد محدد بالبروتين المستهدف.
· الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية – يرتبط جسم مضاد ثانوي متصل بأنزيم مثل HRP أو AP بالجسم المضاد الأولي.
· الكشف – يولد مادة تحتية مثل TMB لـ HRP إشارة لونية أو فلورية أو كيميائية متناسبة مع كمية الهدف.
· الإليزا المباشر– يستخدم جسم مضاد متصل بأنزيم.
· الإليزا غير المباشر– يستخدم كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية لزيادة الحساسية.
· الإليزا الساندويتش– يتطلب اثنين من الأجسام المضادة التقاط والتشخيص لخصوصية عالية.
فوسفور-الإليزا– يكشف عن البروتينات الفسفورية مثل p-ERK، p-AKT.
· كشف الأدوية والتحليل – يقيس آثار المركبات على التعبير أو الفسفرة البروتينية.
· دراسات نقل الإشارة – يقيس تنشيط الكينازات (مثل مسارات JAK-STAT، MAPK).
· الكشف عن السيتوكينات والبروتينات المفرزة – يقيم الاستجابات الالتهابية (مثل TNF-α، IL-6).
· دراسات السموم – يتحليل صحة الخلية (مثل الكاسپاز-3 لأغراض الموت الخلوي).
· اختبارات ربط الليغاند-المستقبل – يدرس تنشيط مستقبلات GPCR أو كينازات التيروزين.
✔ يحافظ على السياق الخلوي – يقيس البروتينات في مكانها، مما يمنع عيوب التحلل.
✔ متوافق مع التحليل عالي الإنتاجية – يمكن تكييفه مع أطباق 384 بئرًا للتحليل.
✔ كمي وحساس – يكشف عن البروتينات ذات الكميات المتدنية (في نطاق pg/mL).
✔ إمكانية تعدد الاستهداف – يوفر بعض الأطقم إمكانية الكشف المتزامن عن عدة أهداف.
القيود
❌ الحاجة إلى التحسين – يجب أن يتم توحيد ظروف التثبيت/الاختراق.
❌ مقيد بالخلايا الملتصقة – قد تحتاج الخلايا المعلقة إلى تغليفات خاصة.
❌ خطر تشبع الإشارة – قد تتجاوز مستويات البروتين العالية النطاق الخطي للكشف.
المواد المطلوبة
· خلايا مزروعة يفضل أن تكون ملتصقة
· طبق ميكروتيتر 96 بئرًا مغلف لزراعة الخلايا
· محلول تثبيت 4% بارافورمالديهايد
· محلول اختراق 0.1% تريتون X-100
· محلول حجب 5% BSA في PBS
· أجسام مضادة أولية وثانوية
· مادة تحتية للإليزا مثل TMB لـ HRP
· قارئ أطباق امتصاص /فلوروسينس
الطريقة
· زراعة الخلايا – ضع 10,000 إلى 50,000 خلية في كل بئر واحتفظ بها في الحضانة طوال الليل.
· معالجة الخلايا – طبق الظروف التجريبية (مثل جرعات الأدوية).
· تثبيت الخلايا – أضف 4% بارافورمالديهايد (15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة)، ثم اغسل بـ PBS.
· الاختراق إذا لزم الأمر) – استخدم 0.1% تريتون X-100 (10 دقائق.
· الحجب – حضن مع 5% BSA ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة.
· جسم مضاد أولي – أضف الجسم المضاد تخفيف 1:1000، ساعتين أو طوال الليل في 4°C.
· جسم مضاد ثانوي – حضن مع الجسم المضاد المتصل بـ HRP ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة.
· الكشف – أضف المادة تحتية، أوقف التفاعل إذا لزم الأمر وقراءة الامتصاص.
تفكيك البيانات
قم بتطبيع بناءً على عدد الخلايا مثل باستعمال صبغة الكريستال البنفسجي.
قارن بين المجموعات المعالجة والمجموعة الضابطة باستعمال منحنيات معيارية إذا لزم الأمر للتقدير المطلق.
الإليزا الخلوية هي أداة قوية لدراسة تعبير البروتين وتغيراته في البيئة الخلوية. توافقها مع التحليل عالي الإنتاجية يجعلها قيمة في تطوير الأدوية والبحوث الطبية الحيوية. من خلال تحسين ظروف التثبيت، مقدارات الأجسام المضادة، وطرق الكشف، يمكن تحقيق نتائج حساسة وقابلة للتكرار. قد تشمل التقدمات المستقبلية منصات للإليزا الخلوية متعددة الأهداف للكشف المتزامن عن عدة محللات في بئر واحدة.