تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)
مقدمة:
تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هو تقنية تحليلية متقدمة تُستخدم لفصل، وتحليل، وقياس المركبات الكيميائية في المحاليل السائلة. تُعتبر HPLC واحدة من أكثر الطرق شيوعًا في الكيمياء التحليلية، والصيدلة، وعلوم المواد، نظرًا لدقتها وفعاليتها في الفصل.
تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي تقنية تحليلية تستخدم تجاذب المركب مع كل من الطور المتحرك (عادةً مذيب ممدد) و الطور الثابت ( صلب مسامي مغطى بطبقة خاصة). يُستخدم مضخة لتوفير تدفق مستمر للمذيب يتم إدخال عينة منحلة فيه. بمجرد إدخال العينة المذابة، ستسير العينة ضمن العمود الفصل الذي يحوي الطورالثابت، ويتم بعدها فصل المواد الكيميائية من ضمن خليط العينات المذابة، اعتمادًا على تفاعلها مع جزئيات غطاء الطور الثابت في عمود الفصل وبعد فصل المكونات في العمود، تمرر من خلال مجموعة من أجهزة الكشف. تُستخدم استجابة الكاشف و "زمن التثبيت" (الوقت اللازم لانتقال المركب ضمن العمود من مرحلة الحقن إلى لحظة الخروج من العمود) للتعرف على المركبات للمادة المحللة. بالإضافة إلى ذلك، يُستخدم عدد من تقنيات الكشف لتحديد نوع محدد من المركبات مثل كاشف (UV – Vis) وكشف التأثير (FLD) أو كشف التبخير بإضاءة خافته (ELSD)
تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء تقنية تحليلية متقدمة تُستخدم لفصل وتحليل المركبات في المحاليل السائلة. يُعتبر HPLC من أكثر الأساليب شيوعًا في مجالات الكيمياء التحليلية، والصيدلة، وعلوم المواد، نظرًا لدقته وسرعته في الفصل.
مبدأ العمل
تقوم تقنية HPLC على مفهوم فصل المركبات بناءً على تفاعلاتها مع الطور الثابت والطور المتحرك. في هذه الطريقة، يُستخدم عمود مملوء بمادة مسامية كطور ثابت، ويتم إدخال المحلول السائل (الطور المتحرك) تحت ضغط عالٍ باستخدام مضخة. يتم فصل المركبات بناءً على اختلافات في التلاصق والتفاعل مع الطور الثابت. عند ضخ المذيب (الطور المتحرك) مع العينة، تمر المركبات خلال العمود بسرعات مختلفة بناءً على تفاعلاتها مع الطور الثابت. المركبات التي تلتصق بالطور الثابت لفترة أطول تستغرق وقتًا أطول للخروج، مما يؤدي إلى فصلها.
تحضير العينة:
يتم إعداد العينة المراد تحليلها، والتي قد تتطلب تخفيفًا أو تنقية قبل التحليل.
إدخال العينة:
يتم إدخال العينة مع المذيب (الطور المتحرك) إلى العمود عبر مضخة ضغط عالية. هذا الضغط العالي ضروري لضمان تدفق المحلول عبر العمود.
فصل المركبات:
تمر المركبات المختلفة خلال العمود بسرعات متفاوتة بناءً على خصائصها مثل التلاصق مع الطور الثابت. المركبات التي تلتصق بقوة أكبر تستغرق وقتًا أطول للخروج من العمود، بينما تمر المركبات الأقل تلاصقًا بسرعة أكبر.
الكشف والتحليل:
بعد مرور المركبات عبر العمود، يتم الكشف عنها باستخدام كاشف مناسب (مثل كاشف الأشعة فوق البنفسجية أو كاشف الفلورة). تُسجل البيانات لتمثل العلاقة بين الوقت والمادة المفصولة، مما ينتج عنه منحنيات تحليلية تُستخدم لتحديد هوية وكمية المركبات.
أنواع الكواشف في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)
تستخدم الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أنواعًا مختلفة من الكواشف لتحليل المركبات المفصولة، ويعتمد اختيار الكاشف في HPLC على طبيعة المحللات، والحساسية المطلوبة، والتطبيق المحدد. كل كاشف له مزاياه وعيوبه، مما يجعل من الضروري اختيار الأنسب لتحقيق تحليل دقيق وموثوق.. وهنا الأنواع الرئيسية من الكواشف المستخدمة في HPLC، مع المبادئ والتطبيقات والمركبات المناسبة لكل منها:
1. كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV)(Ultraviolet Detector)
المبدأ: يقيس امتصاص الضوء فوق البنفسجي من قبل المحللات أثناء خروجها من العمود.
التطبيقات: يستخدم على نطاق واسع للمركبات التي تمتص الضوء فوق البنفسجي، مثل المركبات العطرية والعديد من الأدوية.
العينات المناسبةللقياس: العينات البيئية، المواد الغذائية، المستحضرات الصيدلانية
يستخدم بشكل شائع لتحليل المركبات التي تمتص الضوء فوق البنفسجي كالفينولات، الكيتونات، الأحماض النووية، المركبات العضوية، الأدوية، والمركبات العطرية..
2. كاشف مصفوفة الثنائي (DAD)(Dioed Array Detector)
المبدأ: مشابه لكواشف UV ولكنه يمكنه قياس الامتصاص عند أطوال موجية متعددة في نفس الوقت.
التطبيقات: مفيد في تحديد وقياس المركبات بناءً على أطياف UV الخاصة بها.
العينات المناسبة للقياس: العينات المعقدة مثل المستحضرات الدوائية والمستخلصات النباتية.
يستخدم لتحليل المركبات بناءً على أطياف UV الخاصة بها، مما يساعد في التعرف على المركبات المختلفة جميع المركبات التي لها امتصاصات مميزة في نطاق UV..
3. كاشف مؤشر الانكسار (RID)(Refractive Index Detector)
المبدأ: يقيس التغيرات في مؤشر الانكسار للمرحلة المتنقلة عندما تمر المحللات عبر الكاشف.
التطبيقات: مناسب للمركبات غير النشطة في UV.
العينات المناسبة للقياس: العينات الغذائية، مثل العصائر والحلويات.
يستخدم للكشف عن المركبات غير النشطة في UV، مثل السكريات المركبات غير العضوية والعضوية لسكريات، الكحوليات، وغيرها من المركبات التي لا تمتص UV.
4. كاشف الفلورة (Fluorescence Detector)
المبدأ: يقيس الفلورنسانس المنبعثة من المحللات عندما تتعرض لطول موجي محدد من الضوء.
التطبيقات: حساس للغاية وانتقائي؛ يستخدم في التحليل الدقيق.
العينات المناسبة للقياس: العينات البيولوجية، الأدوية، والمستخلصات النباتية.
يستخدم للكشف عن المركبات الفلورية، ويتميز بحساسية عالية المركبات التي تكون فلورية بشكل طبيعي أو يمكن تحويلها لتصبح فلورية، مثل بعض الأدوية والجزيئات البيولوجية.
5. كاشف الموصلية (Conductivity Detector)
المبدأ: يقيس موصلية الإلنت، التي تتغير مع وجود الأنواع الأيونية.
التطبيقات: شائع الاستخدام في المركبات الأيونية وفي كروماتوغرافيا الأيونات.
العينات المناسبة للقياس: المياه، المحاليل الملحية، والعينات البيئية.
يستخدم في تحليل المركبات الأيونية و الأيونات غير العضوية، الأحماض العضوية، والقواعد.
6. مطياف الكتلة (MS)(Mass Spectrometer Detector)
المبدأ: يحلل الأيونات بناءً على نسبة الكتلة إلى الشحنة بعد تأيينها.
التطبيقات: يوفر معلومات بنيوية وقياس كمي؛ حساس للغاية.
العينات المناسبة للقياس: العينات البيولوجية، الأدوية، والمخاليط الكيميائية.
يستخدم لتحليل المركبات وتحديد هياكلها، ويعتبر أداة قوية في التحليل الكيميائي و مجموعة متنوعة من المركبات العضوية وغير العضوية، خاصة تلك التي يمكن تأيينها..
7. كاشف تشتت الضوء المتبخِّر (ELSD)(Evaporative Light Scattering Detector)
المبدأ: يقيس الضوء المتناثر من الجسيمات التي يتم تشكيلها من المحللات بعد تبخر المرحلة المتنقلة.
التطبيقات: مفيد للمركبات غير الطيارة وشبه الطيارة، خاصة في تحليل الأدوية والأغذية.
العينات المناسبة للقياس: المستحضرات الغذائية، المستخلصات النباتية، والمواد الكيميائية.
يستخدم لتحليل المركبات غير الطيارة وشبه الطيارة كالدهون، البوليمرات، والمركبات العضوية غير الطيارة..
8. مطياف الكتلة مزدوج (MS/MS)(Tandem Mass Spectrometer Detector)
المبدأ: شكل متقدم من مطياف الكتلة يسمح بتفتيت الأيونات لتوفير معلومات بنيوية مفصلة.
التطبيقات: يستخدم للخلائط المعقدة والتحليل الدقيق في دراسة الأدوية والبروتينات.
العينات المناسبة للقياس: العينات البيولوجية المعقدة، الأدوية، والمستحضرات الصيدلانية.
يستخدم لتحليل الخلطات المعقدة وتقديم معلومات بنيوية تفصيلية وقياس العينات البيولوجية المعقدة، الببتيدات، والمستقلبات..
أهميته
دقة عالية: توفر HPLC دقة عالية في قياس تركيز المركبات، مما يجعلها مناسبة لتحليل المواد الدوائية والبيئية.
الصيدلة: التحليل الكمي والنوعي للمركبات الدوائية والمركبات النشطة.
الكيمياء: لفصل وتحليل المركبات في الأبحاث الكيميائية.
علوم المواد: لدراسة خصائص المواد الجديدة.
التحليل البيئي: للكشف عن ملوثات في المياه والتربة.
فصل وتحديد المركبات العضوية في عينة مجهولة
قياس السموم المختلفة في البيئة.
فصل وتشخيص البروتينات والجزيئات الحيوية ومقارنة بنى البروتينات المختلفة..
مراقبة معايير الأدوية والسموم وتحليل المواد الغذائية..
تشخيص وتحديد السوائل غير الطيارة.
التطبيقات المتعلقة بالأحماض الأمينية، فصل وتنقية وتحديد البروتينات (وكذلك أبحاث البروتيوميات)، الأحماض النووية، الهيدروكربونات، الأدوية، التربينويدات، المبيدات الحشرية، المضادات الحيوية، الستيرويدات، الأنواع العضوية ومجموعة من المواد المعدنية المتنوعة، وكذلك في بعض الاختبارات المتعلقة بتحديد تركيز الأدوية.
تحديد بنية البوليمرات.
كفاءة فصل أكبر مقارنة ببعض طرق الكروماتوغرافيا الأخرى.
إعداد العينة القياسية (Standard)
لضمان دقة القياسات، يُفضل إعداد عينة معيارية معروفة للمركب المراد تحليله. يجب اختبار هذه العينة باستخدام نفس ظروف التحليل التي تُستخدم للعينة الأصلية. هذا يساعد في التأكد من أن النتائج الناتجة دقيقة وموثوقة.
العينات القابلة للقياس
يمكن استخدام HPLC لتحليل مجموعة واسعة من العينات، بما في ذلك:
الأدوية: مثل المركبات النشطة في الأدوية.
المركبات الكيميائية: مثل الأصباغ، والمواد الكيميائية الصناعية.
المواد الغذائية: مثل الفيتامينات، والمواد المضافة.
المحاليل البيولوجية: مثل المصل والبول.
تفسير النتائج
تُظهر نتائج HPLC عادةً منحنيات تمثل العلاقة بين الوقت وتركيز المركبات. يتم استخدام الوقت المحتفظ به (Retention Time) لكل مركب لتحديد هويته. يمكن أيضًا حساب التركيز من خلال مقارنة المساحات تحت المنحنيات مع تلك الخاصة بالعينات المعيارية.