المجهر البؤري
مقدمة
المجهر البؤري هو تقنية متقدمة في مجال التصوير المجهري تعتمد على خاصية الفلورية للعينة. يُستخدم بشكل رئيسي لتوليد صور عالية الدقة للهياكل الدقيقة، مما يجعله أداة مهمة في الأبحاث البيولوجية والطب، ويعمل المجهر البؤري من خلال استخدام شعاع ليزر ضيق لتسليط الضوء على العينة. يتم تحفيز الجزيئات الفلورية في العينة لإصدار الضوء، الذي يتم جمعه بواسطة عدسات دقيقة. تستخدم تقنية الفلترة الضوئية لتقليل الضوضاء والتشويش، مما يسمح بالتقاط الصور من طبقات محددة في العينة. من التطبيقات البارزة للمجهر البؤري هو تصوير الخلايا والعينات البيولوجية. بعد تلوين العينة بمواد فلورية، يمكن دراسة بنية الخلايا وأجزائها المختلفة بدقة متناهية. تتيح هذه التقنية للمستخدمين رؤية التفاصيل المعقدة، مثل التفاعلات الخلوية والبنية الدقيقة للأعضاء.
الفائدة من القياس
المجهر البؤري، المعروف أيضًا بالمجهر الماسح بالليزر، هو نوع متقدم من المجاهر الفلورية يستخدم خاصية الفلورية للعينة لتوليد صور دقيقة. لقد garnered اهتمامًا كبيرًا في المجالات الطبية والبيوتكنولوجية، حيث حصل الباحثون على جائزة نوبل في الكيمياء عام 2014 لتطويرهم أنظمة بؤريّة عالية الدقة. ولكي تكون العينة مناسبة للتصوير باستخدام المجهر البؤري أو أي مجهر فلوري آخر، يجب أن تتمتع بخصائص فلورية. هناك تقنيات متنوعة لإنتاج عينات فلورية، وأشهرها هو وضع علامة على العينة باستخدام صبغة فلورية. بالنسبة للخلايا والعينات البيولوجية، يمكن استخدام التعبير عن بروتين فلوري. في الحالات التي تمتلك فيها العينة خصائص فلورية ذاتية، يمكن تصويرها مباشرة دون الحاجة إلى صبغات.
تتوفر العديد من الأصباغ الفلورية التي تضيف خصائص فلورية للتركيبات البيولوجية، ومن بينها:
DAPI: يستخدم لتلوين الحمض النووي.
Hoechst: يُستخدم أيضًا لتلوين الحمض النووي ويتميز بقدرته على اختراق الأغشية الخلوية.
DRAQ5 وDRAQ7: تُستخدم لتلوين الخلايا الحية وتوفير معلومات حول الخلايا والمكونات.
يمتاز المجهر البؤري بقدرته على تقسيم الضوء، مما يؤدي إلى تحسين وضوح الصور الفلورية مقارنةً بالمجاهر الفلورية التقليدية. تعتمد هذه التقنية على استخدام ثقب صغير (pinhole) في المستوى البؤري، مما يساعد على استبعاد الضوء الخارج عن التركيز.
تتيح هذه الميزة تكوين صورة ثلاثية الأبعاد للهياكل العينة من خلال المسح في أعماق مختلفة، مما يُحسن من دقة الصورة ووضوحها، خاصة في العمق
القدرة على التغلغل في أعماق العينة بدقة ووضوح عالٍ.
القدرة على تكوين صورة ثلاثية الأبعاد للهياكل المدروسة.
أنواع العينات القابلة للقياس
الأنسجة البيولوجية: الأنسجة الحيوانية والنباتية بعد التلوين بمواد فلورية.وكذلك الخلايا الحية والمزروعة.
المواد النانوية: الجسيمات النانوية والأفلام الرقيقة التي تم تلوينها بالمواد الفلورية.
البوليمرات: العينات البوليمرية التي تم تحضيرها بشكل شفاف ورفيع، مما يسمح بمرور الضوء.
المركبات الكيميائية: المواد الكيميائية التي تظهر خصائص فلورية، مما يمكن من دراستها باستخدام المجهر الكونفوكالي.
المستحضرات الصيدلانية: تركيبات تحتوي على مواد فلورية، مثل الأدوية المستخدمة في الأبحاث البيولوجية.
المواد البيئية الصلبة: بلورات أو مواد صلبة تم تلوينها بمواد فلورية
شروط القياس
طول موج التحفيز: يجب اختيار طول موج التحفيز (الجهد) للفلورسانس بحيث يكون ضمن نطاق ±5 نانومتر من الأطوال الموجية المحددة.
الألوان المستخدمة: يمكن إجراء التصوير باستخدام حد أقصى من لونين مختلفين، في نطاق الألوان الأخضر والأحمر. لذا، يجب مراعاة المسافة المنطقية بين الأطوال الموجية عند اختيار الألوان.
خصائص العينة:
يجب أن تكون العينة الشفافة (السماح بمرور الضوء) ورفيعة (بسمك أقصى 50 ميكرومتر).
يجب زراعة الخلايا اللاصقة على الشريحة بدلاً من الأطباق أو القوارير.
يجب تجنب إغلاق العينة بين الشريحة والزجاجة.
الامتناع عن وضع الجلسرين أو أي مواد مشابهة على العينة.
يجب أن تبقى العينة رطبة وتُسلم في بيئة عازلة غير فعالة.
يجب إعداد العينة في الظلام، وأن تُحفظ في الظلام أثناء النقل إلى المختبر.
يجب التأكد من أن العينة قد تم فحصها مسبقًا باستخدام المجهر الفلوري وأن الصورة الناتجة مقبولة قبل الزيارة.
تحليل النتائج
1. تفسير الصور
الوضوح والتباين: يجب فحص وضوح الصورة وتباينها. الصور عالية الجودة توضح التفاصيل الدقيقة للهياكل المدروسة، بينما الصور ذات التباين المنخفض قد تشير إلى مشاكل في الإضاءة أو التداخل. العمق: يمكن استخدام القدرة على التصوير في أعماق متعددة لتحديد التركيب ثلاثي الأبعاد للعينة. يجب تحليل الصور المأخوذة من مستويات مختلفة لفهم توزيع الخلايا أو المكونات داخل العينة.
2. تحليل الفلورية
توزيع الفلورة: يجب فحص توزيع الصبغة الفلورية في العينة. يمكن أن يشير التوزيع غير المتجانس إلى وجود تفاعلات بيولوجية أو تغيرات في التركيب.
شدة الفلورة: تحليل شدة الفلورة يمكن أن يساعد في تقدير كمية البروتينات أو الجزيئات المعينة في العينة.
3. الدقة والعمق
تحليل العمق: يمكن استخدام تكنولوجيا التصوير الطبقي (Z-Scan) لتقييم تغيير الفلورية عبر عمق العينة. يساعد هذا في فهم التركيب الداخلي للعينة.
4. البرمجيات والتحليل الكمي
استخدام البرمجيات المتخصصة يمكن أن يساعد في تحليل الصور بشكل كمي، مثل قياس المساحات، وتوزيع الجزيئات، والمعلمات الأخرى ذات الصلة.
يمكن تنفيذ تحليلات إحصائية لتحديد الفروق بين العينات المختلفة أو الحالات المختلفة.
5. التفسير البيولوجي
يجب ربط النتائج المستخلصة من الصور بتحليلات بيولوجية شاملة. يمكن استخدام النتائج لفهم التفاعلات الخلوية، أو تقييم تأثير العلاجات، أو دراسة الظواهر البيولوجية المختلفة.