تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
هو إحدى أهم وأكثر التقنيات استخدامًا في علم الأحياء الجزيئي، وقد أحدثت ثورة في مجال الأبحاث الجينية والطب وعلم الأحياء. توفر هذه التقنية إمكانية تضاعف أجزاء محددة من الحمض النووي (DNA) بدقة وسرعة، وتستخدم في مجالات عديدة، بما في ذلك التشخيصات الطبية، الطب الشرعي، الزراعة، والأبحاث العلمية. في هذه المقالة، سيتم تقديم مقدمة دقيقة حول مبادئ وأجزاء ومراحل وتطبيقات هذه الطريقة.
مبادئ تفاعل البلمرة المتسلسل
يعتمد تفاعل البلمرة المتسلسل على قدرة إنزيم الحمض النووي (DNA) بوليميراز على تصنيع سلسلة جديدة من الحمض النووي (DNA) باستخدام نموذج وبرايمر. إنزيم الحمض النووي (DNA) بوليميراز هو إنزيم يمكنه إضافة نوكليوتيدات إلى سلسلة الحمض النووي (DNA) موجودة وبناء سلسلة مكملة. يتضمن تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عدة دورات من المراحل الحرارية التي تتكرر بشكل متسلسل، وفي كل دورة يتضاعف مقدار الحمض النووي (DNA) الهدف.
المكونات الأساسية لتفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، هناك مكونات محددة مطلوبة، والتي تشمل:
1. إنزيم الحمض النووي (DNA) بوليميراز:
هو الإنزيم المستخدم في تصنيع سلسلة جديدة من الحمض النووي (DNA) في معظم تفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يتم استخدام إنزيم Taq بوليميراز، المستخلص من بكتيريا .Thermus aquaticus هذا الإنزيم مناسب للغاية بسبب استقراره الحراري العالي في درجات الحرارة المرتفعة خلال دورة تفاعل البلمرة المتسلسل . (PCR)
أساس عمل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) :
يعتمد أساس عمل تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على إنزيم الحمض النووي (DNA) بوليميراز. يقوم إنزيم Taq بوليميراز بتحفيز إنتاج سلسلة جديدة من الحمض النووي (DNA) استنادًا إلى الحمض النووي (DNA) النموذج. يتم استخراج هذا الإنزيم من بكتيريا Thermus aquaticus المقاومة للحرارة، والتي تعيش في الينابيع الساخنة والفوهات الحرارية. نظرًا لأن هذه الفوهات تقع في أعماق البحار والمحيطات بالقرب من المواقع البركانية النشطة وتمثل منافذ للهواء الساخن، فإن إنزيمات هذه البكتيريا، بما في ذلك الحمض النووي (DNA) بوليميراز، تتمتع باستقرار حراري عالٍ، حيث تكون الحالة الأكثر نشاطًا لهذا الإنزيم عند درجة حرارة 70 درجة مئوية. يجب ملاحظة أن معظم الإنزيمات البشرية تصبح غير نشطة عند هذه الدرجة.
نشاط الإنزيم:
إحدى الصفات التي تجعل إنزيم Taq بوليميراز مناسبًا وفعالًا لإجراء تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هي مقاومته للحرارة، حيث ترتفع درجة الحرارة بشكل متكرر خلال عملية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لفتح خيوط الحمض النووي (DNA) النموذج وبدء عملية التضاعف مرة أخرى. يزداد نشاط إنزيم Taq بوليميراز بشكل خاص عند درجة حرارة 70 درجة مئوية، وعند حوالي 90 درجة مئوية أو أعلى، يحافظ على نشاطه دون تغير في هيكله، وعند انخفاض درجة الحرارة، يعود إلى حالته النشطة.
يمكن مراجعة نشاط هذا الإنزيم عند درجات حرارة مختلفة كما يلي:
70 درجة مئوية: 60 نوكليوتيد في الثانية
55 درجة مئوية: 24 نوكليوتيد في الثانية
37 درجة مئوية: 1.5 نوكليوتيد في الثانية
22 درجة مئوية: 0.25 نوكليوتيد في الثانية
من الميزات الأخرى المهمة لإنزيم Taq الحمض النووي (DNA) بوليميراز هي قدرته العالية على المعالجة، حيث يمكنه معالجة قطع بطول ثلاثة آلاف نوكليوتيد، ويمكن حتى زيادة هذه القدرة إلى أربعة آلاف نوكليوتيد مع إجراء تغييرات طفيفة في الظروف. من الخصائص البارزة الأخرى لإنزيم Taq الحمض النووي (DNA) بوليميراز هو دقة الأداء وقدرته على تصحيح الأخطاء، حيث إنه في إنزيمات Taq الشائعة يوجد نوكليوتيد خاطئ واحد لكل ثلاثة آلاف قاعدة.
2. البرايمرات:
البرايمرات هي تسلسلات قصيرة من الحمض النووي (DNA) أحادي السلسلة تتصل بالمناطق المكملة لها في الحمض النووي (DNA) النموذج وتحدد نقطة بدء تصنيع الحمض النووي .(DNA) يلعب التصميم المناسب للبرايمرات دورًا مهمًا في دقة وكفاءة التفاعل.
1توضيحات إضافية:
إن إنزيم Taq بوليميراز لديه القدرة على تصنيع سلسلة جديدة فقط في وجود البرايمرات. في الواقع، تعتبر البرايمرات أوليغونوكليوتيدات من الحمض النووي (DNA) توفر مجموعة OH الحرة للإنزيم، وتحدد نقطة البداية له. بمعنى آخر، تكون نقطة البداية هي مجموعة الهيدروكسيل الحرة الموجودة في نهاية 3′ للنوكلوتيد الأخير من جزيء البرايمر.
البرايمرات المطلوبة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)هي قطع قصيرة من الحمض النووي (DNA) أحادي السلسلة، وعادةً ما يكون طولها حوالي 20 نوكليوتيد. يتم تصميم هذه القطع بحيث تغطي المنطقة المستهدفة. لذلك، في كل تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، هناك حاجة إلى برايمرين للارتباط بكل من سلسلتي الحمض النووي (DNA)، ويتم إجراء هذا الارتباط من خلال الروابط الهيدروجينية بين البرايمر والحمض النووي (DNA) النموذج. يُطلق على البرايمر المرتبط بهذه السلسلة "البرايمر الأمامي" (forward primer) والبرايمر المرتبط بالسلسلة المكملة "البرايمر العكسي" (reverse primer).
3. النوكليوتيدات (dNTPs):
النوكليوتيدات هي وحدات بناء الحمض النووي (DNA)، وتشمل الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)، الجوانين ثلاثي الفوسفات (GTP)، السيتيدين ثلاثي الفوسفات (CTP)، والتيميدين ثلاثي الفوسفات .(TTP)
4 . الحمض النووي (DNA) النموذج:
هو عينة الحمض النووي (DNA) التي تحتوي على التسلسل المستهدف المراد تضاعفه.
5. محلول التفاعل:
هو الوسط الذي يوفر الظروف المثلى لنشاط الإنزيم واستقرار الحمض النووي (DNA). عادةً ما يحتوي هذا المحلول على أيونات المغنيسيوم، الضرورية لوظيفة الحمض النووي (DNA) بوليميراز.
2توضيحات إضافية:
إن نشاط أي إنزيم يكون في أعلى مستوياته تحت ظروف معينة. في الواقع، تساعد المحاليل في تشكيل هذه الظروف الخاصة والحفاظ عليها حتى نهاية التفاعل. عادةً ما يكون محلول إنزيم Taq بوليميراز بتركيز 10X، ويحتوي على Tris HCl، KCl، وعادةً MgCl2. يساعد Tris HCl في استقرار الرقم الهيدروجيني بين 8 و9.5. في الواقع، يلعب عاملان دورًا مهمًا في هذا المحلول: الأول هو وجود أيون البوتاسيوم الذي يؤدي إلى تعزيز عملية ربط البرايمرات بالنموذج أثناء عملية التثبيت (annealing)، والثاني هو وجود أيون المغنيسيوم الذي يعمل كعامل مساعد لإنزيم البوليميراز، ويرتبط به لتحقيق أعلى نشاط هيكلي.
مراحل تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
يتضمن تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ثلاث مراحل رئيسية تتكرر في كل دورة:
التحلل (Denaturation):
في هذه المرحلة، يتم تسخين العينة إلى 94-98 درجة مئوية لفصل سلسلتي الحمض النووي (DNA) عن بعضهما. تستغرق هذه المرحلة عادةً من 20 إلى 30 ثانية.
الاتصال (Annealing):
يتم خفض درجة حرارة التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية لارتباط البرايمرات بتسلسلها المكمل على الحمض النووي (DNA) النموذج. يتم تحديد هذه الدرجة بناءً على تصميم البرايمرات، وعادةً ما تستغرق من 20 إلى 40 ثانية.
الاستطالة (Extension):
يتم زيادة درجة الحرارة إلى حوالي 72 درجة مئوية، وهي الدرجة المثلى لنشاط إنزيم Taq بوليميراز. في هذه المرحلة، يضيف الإنزيم النوكليوتيدات إلى نهايات البرايمرات ويقوم بتصنيع سلسلة جديدة من الحمض النووي. (DNA) تستغرق مدة هذه المرحلة حسب طول التسلسل المستهدف، بحيث يكفي عادةً 30 ثانية للتسلسلات القصيرة (حتى 1000 قاعدة). بالنسبة للتسلسلات الأطول، يتطلب الأمر وقتًا أطول.
خلال الدورات المتكررة (عادةً 25 إلى 35 دورة)، يزداد مقدار الحمض النووي (DNA) الهدف بشكل أسي، وفي النهاية يتم إنتاج كميات كبيرة من التسلسل المطلوب.
تطبيقات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
من بين أكثر التطبيقات شيوعًا لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) يمكن الإشارة إلى ما يلي:
دراسة الجينات المؤثرة في الأمراض.
دراسة عوامل الأمراض المعدية.
التشخيص الطبي المناسب.
تضاعف قطعة من النسخ الجيني أو Reverse Transcriptase PCR.
تحديد الهوية.
دراسة دقيقة لعدد نسخ النسخ الجينية (Real-Time PCR).
مقارنة عدد نسخ النسخ الجينية بين جينين آخرين (Semi-quantitative PCR).
تشخيص الأمراض:
يعتبر PCR أداة حيوية في تشخيص العوامل المسببة للأمراض مثل الفيروسات (بما في ذلك فيروس كورونا)، والبكتيريا، والطفيليات. هذه التقنية فعالة بشكل خاص في التشخيص السريع للأمراض المعدية.
الطب الشرعي:
في مجال الطب الشرعي، يُستخدم PCR لتحليل DNA من عينات صغيرة مثل الشعر، والدم، أو اللعاب. تساعد هذه الطريقة في تحديد هوية الأفراد والتعرف على المجرمين.
الأبحاث الجينية:
يلعب تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) دورًا رئيسيًا في اكتشاف ودراسة الجينات، ودراسة الطفرات الجينية، وفهم الأمراض الوراثية بشكل أفضل.
التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي:
يتم استخدام PCR في استنساخ الجينات، ودراسة تعبير الجينات، وإنتاج DNA لأغراض متنوعة.
الزراعة:
في صناعة الزراعة، يُستخدم PCR لتحديد الأمراض النباتية، والتعديل الجيني، وتحديد الكائنات المعدلة وراثيًا (GMO).
مزايا وقيود تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
المزايا:
حساسية عالية: القدرة على تضاعف DNA من كميات صغيرة جدًا من العينات.
السرعة: يمكن أن يتم عملية PCR في غضون ساعات قليلة.
قابلية التكيف: إمكانية استخدامها في تطبيقات متنوعة.
القيود:
حساسية عالية للتلوث، مما قد يؤدي إلى نتائج غير صحيحة.
الحاجة إلى معدات خاصة مثل جهاز السايكل الحراري.
قيود في تضاعف أجزاء طويلة من DNA.
أنواع PCR
من خلال إجراء تغييرات طفيفة في المكونات أو الظروف الحرارية لـ PCR، يمكن تحسين هذا التفاعل لأغراض مختلفة، ومنها:
qPCR أو Real-Time PCR
Multiple PCR
Nested PCR
High Fidelity PCR
Fast PCR
Hot Start PCR
GC-Rich PCR
Long-range PCR
Arbitrary Primed PCR