تصميم البادئ (البرايمر)
البرايمر هو جزيء صغير أحادي السلسلة من نوع الحمض النووي (DNA) يشارك في تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، حيث يوفر مجموعة الهيدروكسيل الحرة عند الطرف 3′ للإنزيم Taq polymerase. كما هو معروف، في جينوم الكائنات المعقدة مثل الإنسان، يعمل فقط أحد سلسلتي الحمض النووي (DNA) كنقطة نشطة في كل منطقة. عادةً ما يكون الهدف من إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تكثير هذه المنطقة، والتي تُعرف بـ "المنطقة المستهدفة" (Target Region). يتطلب ذلك وجود برايمرين، حيث يرتبط أحدهما بالسلسلة المستهدفة والآخر بالسلسلة المكملة.
تُسمى هذان البرايمران، على التوالي، "البرايمر الأمامي" (Forward) و"البرايمر العكسي" (Reverse)، ويتم الإشارة إليهما بالاختصارات F وR. يرتبط اتصال البرايمرات بجزيء القالب بناءً على الروابط الهيدروجينية، حيث يرتبط الطرف 5′ للبرايمر بالطرف 3′ لجزيء القالب.
اتصال البرايمر
في كل منطقة، تحتوي واحدة فقط من سلسلتي الحمض النووي (DNA) على الجين النشط. تُعرف هذه السلسلة باسم "الأنتي سينس" (Anti-Sense)، وتكون تسلسلاتها في الواقع معكوسة لما هو مسجل في قواعد البيانات كـ تسلسل الجين. وفقًا لاتفاقية عالمية، تقدم جميع قواعد البيانات تسلسل النسخة الجينية - وليس الجين نفسه - ولهذا السبب، يكون كودون البداية لجميع تسلسلات البروتينات المشفرة هو "ATG"، والذي يُترجم مباشرةً إلى ميثيونين. هذا التسلسل هو في الواقع "AUG" الموجود في mRNA، وقد تم نسخه من مكملها أي TAC في الحمض النووي (DNA) الأنتي سينس.
السلسلة الأخرى من الحمض النووي (DNA) التي لا تحتوي على أي تسلسل مشفر في المنطقة المعنية تُعرف باسم "السينس" (Sense)، ويُطلق عليها هذا الاسم لأن تسلسلها في الاتجاه 5′→3′ يتطابق تمامًا مع النسخة mRNA. يجب أن يرتبط البرايمر الأمامي بالسلسلة الأنتي سينس، ولذلك يتم تصميمه بحيث يكون نوكليوتيد الطرف 5′ مكملًا لنوكليوتيد الطرف 3′ في المنطقة المستهدفة من السلسلة الأنتي سينس.
وبالتالي، إذا تحركنا على طول السلسلتين (البرايمر والنسخة - التي تم قبول تسلسلها كجين) في الاتجاه 5′→3′، سنواجه ترتيبًا متطابقًا من النوكليوتيدات. لذلك، يُطلق على هذا البرايمر اسم "الأمامي". ينطبق نفس الأمر على البرايمر العكسي. يرتبط هذا البرايمر بالسلسلة المقابلة من الحمض النووي (DNA) السلسلة السينس) وتكون تسلسلته في الاتجاه 5′→3′، معكوسة ومكملة للسلسلة المستهدفة (الجين.
قبل أن نبدأ في استعراض مبادئ تصميم البرايمرات، يجب أن نتعرف على مصطلحين علميين:
الكفاءة (Efficiency):
يُعبر هذا المصطلح عن مدى نجاح البرايمر في الارتباط بتسلسله المكمل في المنطقة المستهدفة وإنتاج الناتج النهائي. الكفاءة العالية لزوج من البرايمرات تؤدي إلى إنتاج كمية كبيرة من الناتج، وبالتالي وجود شريط قوي جدًا في هلام اللكتروفورز.
الخصوصية (Specificity):
يُعبر هذا المصطلح عن مدى قدرة الإنزيم على الارتباط فقط بتسلسله المكمل في المنطقة المستهدفة، وليس بأي نقطة أخرى من جزيء القالب. كلما زادت خصوصية زوج من البرايمرات، انخفضت شدة الأشرطة غير الخاصة في هلام الإلكتروفورز.
أحيانًا، قد يكون الحفاظ على هاتين الميزتين في زوج من البرايمرات مصحوبًا بصعوبات، حيث غالبًا ما يتطلب زيادة واحدة منهما تقليل الأخرى. من ناحية أخرى، عند تصميم البرايمرات، يجب أيضًا مراعاة نقاط مثل درجة حرارة الارتباط، ونسبة GC، وغيرها من العوامل، مما يجعل عملية تصميم البرايمرات موضوعًا معقدًا ولكنه حيوي.
الميزات المؤثرة على كفاءة وخصوصية البرايمر تشمل:
طول البرايمر
درجة انصهار البرايمر (Melting Temperature)
درجة حرارة ارتباط البرايمر بالقالب (Primer Annealing Temperature)
نسبة GC في طول تسلسل البرايمر (GC-Content)
مقبض GC (GC Clamp)
الهياكل الثانوية (Secondary Structures)
التسلسلات المتكررة (Repeats)
وجود تكرارات متتالية من نوكليوتيد واحد (Run)
استقرار الطرف 3′
منع تشكيل البنى الثانوية في جزيء القالب
طول البرايمر
عادةً ما يتم ضبط خصوصية البرايمر عن طريق تغيير طول هذا الجزيء، مما يؤدي بدوره إلى تغيير درجة حرارة مرحلة الارتباط. في معظم الحالات، تكون البرايمرات بطول 18 إلى 24 نوكليوتيد ذات خصوصية عالية، وفي هذه النطاق، يؤدي زيادة كل نوكليوتيد إلى تعزيز خصوصية البرايمر بمقدار 4 مرات. تقليل طول هذه السلاسل يؤثر بشدة على قدرتها على الارتباط بشكل خاص، بحيث يمكن أن ترتبط البرايمرات التي يقل طولها عن 15 نوكليوتيد بأي نقطة من الجينوم.
على الرغم من أن هذه الخاصية تؤدي إلى عدم فعاليتها في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)s الشائعة، إلا أن هذا الارتباط العشوائي يتيح استخدامها في تفاعلات محددة مثل "تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام برايمرات عشوائية" (Arbitrary PCR) والتي تُستخدم في رسم الخرائط الجينومية للكائنات البسيطة.
على الرغم من عدم وجود قيود على زيادة طول البرايمرات، يمكن تصميمها بطول كبير، ولكن يجب دائمًا مراعاة أن زيادة طول البرايمر سترفع درجة حرارة مرحلة الارتباط ووقتها، بالإضافة إلى زيادة احتمال تشكيل الهياكل الثانوية والديمرات.
بشكل عام، تُستخدم البرايمرات بطول 28 إلى 35 نوكليوتيد فقط عندما تُظهر العينة القالب مستويات من "عدم التجانس" (Heterogenicity)، أو عندما يرغب الباحث في ربط تسلسل محدد - مثل موقع قطع إنزيمي - بها. ومن الواضح أنه في هذه الحالة، لن يرتبط جزء من تسلسل البرايمر في الجولة الأولى من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بالقالب. لحل هذه المشكلة، يتم اعتبار درجة حرارة الارتباط في الجولات الأولى أقل، ثم يتم زيادتها تدريجيًا في الجولات اللاحقة.
برامج تصميم البرايمر
في الوقت الحاضر، تتوفر العديد من البرامج المختلفة لتصميم البرايمرات، والتي يمكن أن تؤدي إلى تقليل كبير في الوقت والتكلفة والجهد البشري. النقطة الجديرة بالاهتمام حول العمل مع هذه البرامج هي الاختلاف في النتائج التي تنتجها. قد يكون هذا الأمر مربكًا بعض الشيء، خاصة بالنسبة للباحثين الأقل خبرة.
يجب أن تلاحظ أن هذا الاختلاف غالبًا ما يكون ناتجًا عن الخوارزمية التي تعمل بها هذه البرامج، وأحيانًا، مع تغيير بعض الافتراضات في البرنامج، يمكنك الوصول إلى نتائج متطابقة. وهنا بعض من البرامج الشائعة في مجال تصميم البرايمرات:
: Oligoيُعتبر من أكثر البرامج استخدامًا وسهولة. يتيح للمستخدم تصميم وتحليل ومقارنة زوج من البرايمرات أو مجموعة منها. تشمل هذه التحليلات فحص الميزات المختلفة للبرايمرات المقترحة، بما في ذلك الهياكل الثانوية، مواقع الارتباط الخاطئ، الاستقرار الداخلي وبعض الميزات الفيزيائية. مع اتصال بالإنترنت، يمكن لـ Oligo الحصول على بعض البيانات المطلوبة مباشرة من قاعدة بيانات NCBI وتخزينها.
: Premierيقوم تلقائيًا بتنفيذ جميع التعليمات اللازمة لتصميم زوج جيد من البرايمرات. يمكنك من تصميم برايمرات خاصة أو عشوائية لتسلسل فردي أو مجموعة "محاذاة" (Alignment). كما يوفر البرنامج إمكانية فحص مواقع قطع الإنزيم، تحليل قطع الكنتيج وتصميم برايمرات لتحديد التسلسل.
Allele ID و: Beacon Designer هما برنامجان تم تحسينهما لـ qتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). يُستخدم هذين البرنامجين في تصميم البرايمرات والبروبيات اللازمة لتحديد المركبات.
: PrimerPlexهو برنامج يمكنك من تصميم البرايمرات المطلوبة لـ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المتعدد (Multiplex تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)) ودراسات SNP المتعددة في تحديد النمط الجيني.