تفاعل البلمرة المتسلسل العكسي (RT-PCR) و تحليل البيانات
تُعد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) واحدة من أدق الطرق لتحليل التعبير الجيني، مما يعني أنه يمكننا تحديد ما إذا كان التعبير عن جينات معينة سيزداد أو ينقص تحت ظروف معينة، أو سيبقى بلا تغيير. قبل ظهور تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي، كانت الطرق الأكثر شيوعًا لتحديد مستويات التعبير الجيني تشمل: Northern blotting، RNase protection assays، و . endpoint reverse transcription (RT) PCR . كانت RT-PCR تُستخدم بشكل أكبر مقارنةً بالطريقتين الأخريين بسبب سهولة إجرائها واحتياجها الأقل للـ الحمض النووي الريبوزي (RNA) ومع ذلك، يمكن باستخدام هذه الطريقة فقط رؤية مستويات التعبير الجيني في نهاية التفاعل من خلال إجراء electrophoresis لمنتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على هلام أغاروز. وبالتالي، يمكن أن تكون RT- PCR مفيدة بشكل أكبر لتحديد وجود أو عدم وجود جين معين. في الواقع، يعتبر هذا الاختبار نوعًا من الاختبارات النوعية أو شبه الكمية. لذلك، لا يمكن باستخدام RT-تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) إجراء تحليل كمي للتعبير عن جين معين، مما يبرز الحاجة إلى استخدام طريقة أخرى تكون كمية بالكامل.
في الواقع، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو نفس RT-(PCR)، ولكن مع استخدام مواد فلوروسنت، يتم تحديد تكاثر وزيادة عدد نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) أثناء التفاعلفي هذه الطريقة، يتم استخدام مواد تشير إلى وقت تنفيذ كل دورة من التفاعل، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق وكمي للتعبير الجيني. بناءً على ما تم ذكره، فإن وجود ضوابط (بمعنى خلايا لا تحتوي على أي تغييرات مطبقة) في إجراء هذا الاختبار أمر ضروري.
مزايا RT-PCR تفاعل :
قياس عدد نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) للجين في البداية وتحديد أصغر اختلاف في مستويات التعبير بين العينات.
ملاحظة الزيادة التدريجية لمنتجات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) خلال التجربة.
عدم الحاجة إلى electrophoresis لهلام أغاروز، مما يقلل من احتمالية التلوث في هذه المرحلة.
المواد اللازمة لإجراء الاختبار:
مجموعة استخراج total RNA.
مجموعة تصنيع cDNA.
مجموعة Master Mix لـ RT-PCR .
جهاز Thermo cycler.
خطوات اختبار RT-تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)
أول مرحلة في إجراء اختبار RT- (PCR) هي استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والتي تختلف حسب نوع العينة. بشكل عام، يمكن إجراء استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) بطرق مختلفة:
طرق الاستخراج العضوية باستخدام مواد مثل Trizol، Qiazol ، والحمض النووي الريبوزي (RNA) STAT-60T، بالإضافة إلى الطرق القائمة على . Guadinium salt
أنواع مختلفة من مجموعات فصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام phase solid، والتي تتوفر تجاريًا من شركات مختلفة.
من المهم أن يتم استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من جميع العينات بطريقة متسقة. إذا لم يتم اختبار الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص على الفور، يجب تخزينه في فريزر عند -20 درجة مئوية لمدة شهر، ولأوقات أطول في فريزر عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يشير نسبة الامتصاص عند الطول الموجي 260/280 لـ الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص إلى جودة الاستخراج؛ إذا كانت هذه النسبة 1.8، فإن ذلك يدل على جودة جيدة لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA)
إجراء النسخ العكسي (Reverse Transcription)
لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي، يلزم تصنيع cDNA من الحمض النووي الريبوزي RNA تم تطوير مجموعات مختلفة لهذا الغرض من قبل الشركات، وجميعها تعتمد على نفس المبدأ. جميع هذه المجموعات تستخدم أنزيم MMLV، وهو أنزيم reverse transcriptase. من المواد الأخرى المستخدمة في إنتاج cDNA يمكن الإشارة إلى random hexamer أو Oligo dT، والتي تعمل كمواد أولية للأنزيم المعني. بعد إضافة هذه المواد بتركيز تحدده الشركة المصنعة، يتم وضع التفاعل في جهاز تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عند درجة حرارة ووقت معينين، يتم تحديدهما أيضًا بواسطة الشركة المصنعة. من الضروري أن يتم استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) من جميع العينات بنفس الكمية لتصنيع cDNA ، لأن هذا الاختبار يجب أن يظهر زيادة في التعبير عن mRNA لجين معين بنفس الكميات من الحمض النووي الريبوزي (RNA).
الضوابط الداخلية
في إجراء اختبار RT-PCR ، بالإضافة إلى الجينات المستهدفة لتحديد مستويات التعبير، يجب إضافة جين آخر كجين منزل (Housekeeping).وتتمثل وظيفة هذا الجين في توضيح صحة بناء cDNA ، ونقاء الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخرج، وصحة إجراء اختبار تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وكذلك تطبيع التعبير عن الجينات الأخرى. لذلك، يجب أولاً )تصميم أو أخذها من المقالات( وبناء مواد أولية لجميع الجينات التي سيتم اختبارها قبل القيام بأي شيء. في كل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، من الضروري وجود هذه المواد إنزيم (DNA) polymerase المسمى Taq)، buffer MgCl2، dNTP، المواد الأولية، وأخيرًا . cDNA
الضبط السلبي
من المهم الإشارة إلى أنه في جميع الاختبارات، يتم إجراء تفاعل إضافي لكل جين يحتوي على جميع المواد الموجودة في تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستثناء cDNA تكمن ضرورة إجراء هذا التفاعل الإضافي في التحقق من عدم وجود تلوث في العينات وعدم وجود تفاعلات مثل primer dimers في الاختبار.
مصادر الخطأ:
عدم استخراج RNA بشكل صحيح.
عدم نقاء RNA الكافي.
عدم تصنيع cDNA.
خطأ في إضافة مواد PCR.
عدم معايرة جهاز PCR.
تلوث في أي مرحلة من العمل.
عدم تصميم مواد أولية مناسبة وخاصة.
وجود تلوث من DNA الخلوية.
التحليلات الكمية في RT-تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
هناك طريقتان رئيسيتان للتحليل الكمي في RT-PCR :
1- طريقة المنحنى القياسي (المقارنة المطلقة):
في هذه الطريقة، يتم استخدام عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي (DNA) بتركيز محدد لرسم منحنى قياسي. يتم تحديد تركيز الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي (DNA) القياسي باستخدام spectrophotometer (nm260) ثم يتم تحويله إلى عدد النسخ بناءً على الوزن الجزيئي للعينة. يمكن شراء المعايير التركيزية لجينات معروفة تجاريًا، على الرغم من أنها مكلفة جدًا. يتم إعداد سلسلة من العينات القياسية ثم توضع مع العينة المستهدفة في جهاز تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي. باستخدام Ct الذي يعطينا الجهاز لكل تخفيف، يتم رسم منحنى حيث تكون X هي التخفيض أو عدد النسخ من الجين وY هو CT. المنحنى الناتج هو منحنى خطي، والذي عند إدخال رقم العينة المستهدفة في المنحنى، يتم الحصول على تركيزها أو عدد نسخها. ويفضل أن يكون طول القطعة القياسية مساويًا لطول القطعة المستهدفة.
2- طريقة العتبة النسبية (المقارنة النسبية):
لإزالة تقلبات كميات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المدخلة في التفاعل وأخطاء أداء الأجهزة والأفراد، يتم استخدام المعايير الداخلية. يجب أن يكون لهذه المعايير تعبير ثابت في جميع الأنسجة، ولا ينبغي أن يغير اختبارنا تعبيرها مقارنةً بالعينة الضابطة. لهذا الغرض، يتم استخدام جين Beta-actin وGAPDH، والتي تعرف باسم Housekeeping genes. تعبير هذه الجينات ثابت، ويمكن من خلال مقارنة العينة المعالجة مع الشاهد والضابط الداخلي ملاحظة الزيادة أو النقص في التعبير.
الكشف عن تعدد الأشكال بواسطة RT-PCR
تتيح لنا هذه التقنية تحديد كميات المناطق المتعددة الأشكال من الحمض النووي (DNA) أو تحديد الأنماط الجينية لتعدد الأشكال النقطية (SNPs) جديدة. يتم تمكين مراقبة عملية التكاثر وتحديد النمط الجيني في وقت واحد باستخدام hybridization للبروبيات وتحليل منحنى الذوبان. يتم الكشف عن الطفرات النقطية من خلال تحليل منحنى الذوبان. تعتبر درجة الحرارة الحرجة Tm، حيث يصبح الحمض النووي (DNA) أحادي السلسلة، مؤشرًا على وجود أو عدم وجود طفرة. يتم إعداد بروب خاص للمنطقة المتحورة، حيث يرتبط البروبان بالمناطق غير الخاصة عند درجات حرارة منخفضة، ومع زيادة الحرارة، يعمل البروبان بشكل أكثر تخصصًا. نقوم بتحليل منحنى الذوبان الناتج من هذا التفاعل لتحديد وجود أو عدم وجود الطفرة.
