تاقیکردنەوەی ژەهراوی بوونی خانەیی (تاقیکردنەوەکانی MTT، XTT و LDH)
جۆرەکانی تاقیکردنەوەی ژەهراوی بوونی خانەیی
تاقیکردنەوەی MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
شێواز:
ئەم تاقیکردنەوەیە لەسەر چالاکی ئەنزیمی خانە زیندووەکان دامەزراوە کە تێکەڵەیەک بە ناوی MTT دەگۆڕن بۆ شێوەیەکی ڕەنگاوی بە ناوی formazan. بڕی MTT کە دەگۆڕدرێت بۆ شێوەی ڕەنگاوی بەندە بە ژمارەی خانە زیندووەکان.
ئەنجامەکان:
کەمبوونەوەی هەڵمژینی ڕەنگ نیشاندەری ژەهراوی بوونی خانەییە، چونکە کەمتر خانەی زیندوو دەتوانن MTT بگۆڕن.
ڕوونکردنەوەی زیاتر:
تاقیکردنەوەی MTT بۆ هەڵسەنگاندنی ژیانی خانە یان بۆ هەڵسەنگاندنی کاریگەری ژەهراوی بوونی دەرمان یان ئامێرەکانی تر لەسەر خانەکان بەکاردێت. بە کاریگەرکردن لەسەر ئۆرگانێلە ناوخانەییەکان، دەتوانێت جیاوازی لە نێوان خانە زیندوو و مردووەکاندا بکات.
چالاکی و ڕێژەی زیادبوونی خانەکان لەوانەیە کاریگەری هۆرمۆن، هۆکاری گەشە، cytokine و mitogen بەسەردا بێت، کە دەبێتە هۆی زیادبوون یان هیچ گۆڕانکارییەک.
هەروەها، هەندێک دەرمان و ئامێری ژەهراوی بوونی خانەیی، وەک دەرمانی دژە شێرپەنجە، لەوانەیە ببنە هۆی مردن، apoptosis، یان کەمبوونەوەی ڕێژەی زیادبوون و گەشە، یان ئەنجامی تێکچوونی پێکهاتەی خانە.
تاقیکردنەوەی MTT شێوازێکی colorimetric ە کە لەسەر کەمکردنەوە و پارچەپارچەکردنی کریستاڵە زەردەکانی tetrazolium لەلایەن ئەنزیمەکانی succinate dehydrogenase دامەزراوە، کە دەبێتە هۆی دروستبوونی کریستاڵە مۆرەکانی formazan کە ناتوێنەوە. بەپێچەوانەی شێوازەکانی تر، ئەم ڕێبازە قۆناغەکانی شوشتن و کۆکردنەوەی خانە نامێنێت، کە زۆرجار دەبێتە هۆی لەدەستدانی خانە و زیادبوونی هەڵە. لە ئەنجامدا، هەموو قۆناغەکانی تاقیکردنەوە لە کولتووری خانەوە تا خوێندنەوەی ئەنجام لەگەڵ فۆتۆمیتەر، هەروەها لێکدانەوەی تاقیکردنەوەکە، لە microplate دا ئەنجام دەدرێت، کە دووبارەکردنەوە، وردی، و هەستیاری تاقیکردنەوەکە بەرز دەکاتەوە.
تاقیکردنەوەی ژەهراوی بوونی خانەیی MTT یەکێکە لە شێوازە ئاساییەکان بۆ خوێندنەوەی کاریگەری ژەهراوی بوونی مادەکان لەسەر خانەکان لە in vitro دا. لەم شێوازەدا، خانەکانی پەروەردەکراو لە تاقیگەدا لەگەڵ مادەکاندا چارەسەر دەکرێن بۆ هەڵسەنگاندنی ژەهراوی بوونی خانەییەکەیان.
ئەنجامەکە ژیانی خانەکان بۆ هەر چڕییەک لە مادەی تاقیکراو نیشان دەدات. هەرچەندە ئەم شێوازە بنەڕەتی بۆ تێکەڵە توێکراوەکان و توێژراوەکان دیزاین کراوە، ئێستا بۆ تێکەڵە توێکراوەکانی تری تۆو لە توێکەری ئۆرگانی و نانۆذەرراتیش بەکاردێت. ئەم شێوازە زۆرترین بەکارهێنانی هەیە بۆ هەڵسەنگاندنی ژەهراوی بوونی مادەکان و فۆرمولاسیۆنەکان. ئەم ژەهراوی بوونە دەتوانرێت لەسەر هێڵە خانەی نەخۆش، وەک خانەی شێرپەنجە، بۆ خوێندنەوەی دەرمان، یان لەسەر خانەی تەندروست بۆ دڵنیایی لە سەلامەتی تێکەڵەکان پشکنین بکرێت.
بنەمای کارکردنی تاقیکردنەوەی MTT:
تاقیکردنەوەی MTT:
تاقیکردنەوەیەکی ڕەنگی (کالۆریمەتری) کە بەندە بە هەڵسەنگاندنی چالاکی میتابۆلیکی خانە زیندووەکان. بنەمای تاقیکردنەوەکە لەسەر ئەوەیە کە ئەنزیمەکانی ئۆکسیدۆردوکتازی خانەیی کە پشت بە NADPH یان NADH دەبەستن، پێکهاتەی تیترازۆلیۆمی زەردی (MTT) کەمدەکەنەوە بۆ بلوورەکانی فۆرمازانی مۆری کە ناتوێنەوە.
تەنها خانە زیندووەکان توانای ئەنجامدانی ئەم تێکەڵبوونە بایۆلۆجییەیان هەیە.
بەڵام خانە مردووەکان یان زیانلێکەوتووەکان، ئەم توانایەیان لەدەستدەدات، بۆیە فۆرمازان لە ناویاندا درووست نابێت.
بلوورەکانی فۆرمازانی دروستبوو بە بەکارهێنانی توێنەرەکان وەک دووئیمیسیل سولفۆکساید (DMSO) دەتوێنەوە، ئەمەش ڕێگە دەدات بۆ خوێندنەوەی هەڵمژینی ڕووناکی بە بەکارهێنانی ئامێری پێوانی سپێکتر (Spectrophotometer) لە درێژی شەپۆلی دیاریکراودا (بەزۆری 570 نانۆمەتر).
بۆیە، تووندی ڕەنگی مۆری دروستبوو ڕاستەوخۆ هاوتایە لەگەڵ ژمارەی خانە زیندووەکان لە نموونە تاقیکراوەکەدا.
وەڵامی تاقیکردنەوەی ژەهراوی بوونی خانەیی:
یەکێک لە شێوازە باو و خێراکان بۆ هەڵسەنگاندنی ژەهراوی بوونی خانەیی دەرمانەکان شێوازی MTT ە، کە لەسەر دروستبوونی ڕەنگی formazan بەهۆی کەمکردنەوەی MTT (dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium bromide) یان خوێی tetrazolium ی تر دامەزراوە. شەقکردنی بازنەیی tetrazolium لەلایەن ئەنزیمە مایتۆکۆندریاییەکانەوە لە خانە زیندووەکاندا دەبێتە هۆی دروستبوونی کریستاڵە مۆرەکانی formazan کە ناتوێنەوە.
دروستبوونی ئەم کریستاڵانە نیشاندەری چالاکی ئەنزیمەکانی زنجیرەی هەناسەدانە و وەک پێوەرێک بۆ ژیانی خانە کاردەکات. بە پێوانی هەڵمژین بە spectrophotometer لە درێژی شەپۆلی تایبەتدا، ڕێژەی خانە زیندووە ماوەکان دیاری دەکرێت. ئەم ڕێژەیە بەم شێوەیە هەژماردەکرێن دەکرێت:
ڕێژەی خانە زیندووەکان = تێکڕای هەڵمژینی نموونە کۆنترۆڵەکان/تێکڕای هەڵمژینی نموونە چارەسەرکراوەکان×100
هۆکارە کاریگەرەکان لەسەر ئەنجامەکانی تاقیکردنەوەی MTT:
کاتی چارەسەرکردن: بەزۆری خانەکان دوای 24، 48، یان 72 کاتژمێر لە چارەسەرکردنەوە هەڵدەسەنگێنرێن.
جۆری هێڵە خانەیی بەکارهاتوو: بێجگە لەوەی خانەکان سروشتی بن یان خانەی شێرپەنجە.
چڕی خانە چاندراوەکان: چڕی خانەیی کاریگەری لەسەر ڕێژەی هەڵمژینی ڕەنگ و ئەنجامەکانی ژەهراویی هەیە.
شێوازی ئامادەکردن و مامەڵەکردن لەگەڵ نموونەکان: وەک وردی زیادکردنی مادەکان و تێکەڵکردنی نموونەکان.
تاقیکردنەوەی XTT
(Sodium 3'-[1-(phenylamino)-carbonyl]-3, 4-tetrazolium-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid)
• ڕێگەکە: هاوشێوەی تاقیکردنەوەی MTT، لەسەر کەمکردنەوەی پێکهاتەی XTT لەلایەن خانە زیندووەکانەوە بۆ بەرهەمێکی ڕەنگین کە دەتوێنێتەوە دەوەستێت، و هاوتایە لەگەڵ ژمارەی خانە زیندووەکان.
• ئەنجامەکان: زیادبوونی ڕەنگی دروستبوو ڕەنگدانەوەی بەرزبوونەوەی ژمارەی خانە زیندووەکانە، لە کاتێکدا کەمبوونەوەی ڕەنگ ئاماژە بە زیادبوونی ژەهراویی خانەیی دەکات.
تاقیکردنەوەی LDH (Lactate Dehydrogenase)
ڕێگەکە:
ئەم تاقیکردنەوەیە چالاکی ئەنزیمی LDH لەناو ناوەندی کشتوکاڵی خانەکاندا دەپێوێت. بەزۆری LDH لەناو خانەکاندا دەبینرێت، و کاتێک زیان بە پەردەی خانەیی دەگات بۆ ناوەندی کشتوکاڵ دەردەچێت.
ئەنجامەکان:
زیادبوونی ئاستەکانی LDH لەناو ناوەندی کشتوکاڵدا ئاماژە بە زیانگەیشتن بە خانەکان و ژەهراویی دەکات.
تاقیکردنەوەی Trypan Blue Exclusion
ڕێگەکە:
تاقیکردنەوەی دەرکردنی تریپان زەرق لەسەر بنەمای جیاکردنەوەی خانە زیندووەکان لە مردووەکان لە ڕێگەی بۆیەی تریپان بلوو دەوەستێت. بۆیەکە دەخرێتە سەر شلی خانەکان، تەنها دەچێتە ناو پەردەی خانە زیانلێکەوتووەکان (مردووەکان)، ئەمەش وادەکات بە ڕەنگی شین ڕەنگبکرێن، لە کاتێکدا خانە زیندووەکان بەهۆی سەلامەتی پەردەی خانەییەوە بێڕەنگ دەمێننەوە.
ئەنجامەکان:
ژەهراویی لە ڕێگەی ژماردنی ژمارەی خانە بۆیەدراوەکان (مردووەکان) و بەراوردکردنیان لەگەڵ کۆی گشتی ژمارەی خانەکان لە نموونەکەدا هەڵدەسەنگێنرێت، ئەمەش ڕێژەیەکی خەمڵاندنی بۆ مانەوەی خانە زیندووەکان دابینداکات.
تاقیکردنەوەی Comet Assay
ڕێگەکە:
تاقیکردنەوەی Comet Assay بە تاقیکردنەوەی گواستنەوەی کارەبایی DNA یەک خانەیی (Single Cell Gel Electrophoresis) ناسراوە. ئەم ڕێگەیە لەسەر هەڵسەنگاندنی زیانگەیشتن بە DNA لەناو خانە تاکەکەسەکاندا دەوەستێت. خانەکان لە چینێکی تەنکی جێڵدا (بەزۆری لە ئاگارۆز) هەڵدەواسرێن، پاشان بەردەوامی گواستنەوەی کارەبایی دەکرێن. لە خانە زیانلێکەوتووەکاندا، پارچەکانی DNA لە ناوک دوور دەکەونەوە بەرەو قوتبی پۆزەتیڤ، نەخشەیەک دروستدەکەن کە دەچێتە ئەو کلکە ڕووناکە کە لە ژێر مایکرۆسکۆپی فلۆری دەچێتە "دمەنداری".
ئەنجامەکان:
درێژی و چڕی کلکی دمەنداری ئاماژە بە قەبارەی زیانگەیشتن بە DNA دەکات.
خانەکان کە زیانی DNA زیاتریان هەیە کلکی درێژتر و چڕتر نیشاندەدەن.
خانە تەندروستەکان ناوکێکی خڕی بێ کلکی ڕوون نیشاندەدەن.
تاقیکردنەوەی Comet Assay لە بەرفراوانی بۆ هەڵسەنگاندنی زیانە جینییەکان کە لە هۆکارە کیمیایی، تیشکی، یان ژینگەیی جیاوازەکانەوە سەرچاوە دەگرن بەکاردێت.
تاقیکردنەوەی CellTiter-Glo
ڕێگەکە:
تاقیکردنەوەی CellTiter-Glo بۆ پێوانی ئاستەکانی ئادێنۆزین سێ فۆسفات (ATP) وەک بەڵگەیەک لەسەر زیندووبوونی خانەکان بەکاردێت. بەرهەمهێنانی ATP تەنها لە خانە زیندووەکاندا ڕوودەدات، ئەمەش چڕی وەک نیشانەیەکی ڕاستەوخۆ بۆ ژمارەی خانە بایۆلۆجی چالاکەکان لە نموونەکەدا دەکات. ئەم ڕێگەیە لەسەر تێکەڵبوونێکی ئەنزیمی دەوەستێت کە دەبێتە هۆی دەرپەڕینی ڕووناکی (Luminescence) کە هاوتایە لەگەڵ بڕی ATP موجود.
ئەنجامەکان:
کەمبوونەوەی ئاستەکانی ATP پێواو ئاماژە بە کەمبوونەوەی ژمارەی خانە زیندووەکان دەکات، ئەمەش ڕەنگدانەوەی بەرزبوونەوەی ژەهراویی خانەیی یان خراپبوونی چالاکی خانەیی.
هەنگاوەکانی ئەنجامدانی تاقیکردنەوەکانی ژەهراویی خانەیی
ئامادەکردنی نموونە: مادە یان پێکهاتەی ئەوەی پێویستە تاقیبکرێتەوە ئامادە دەکرێت، پاشان بۆ چڕی جیاواز کە گونجاوە بۆ ئەزموونەکە کەمدەکرێتەوە.
کشتوکاڵی خانەکان: خانە گونجاوەکان بۆ تاقیکردنەوە لە ناوەندی کشتوکاڵی گونجاودا لەژێر شێوازی پاک دەچێندرێن، پاشان بۆ پلەتەکانی کشتوکاڵ یان قاپە تاقیگەییەکان دەگوازرێنەوە بۆ ئامادەکردن بۆ تاقیکردنەوە.
بەردەوامکردنی خانەکان بۆ مادەی تاقیکراو: دوای جێگیربوونی خانەکان، بۆ چڕی جیاواز لە مادەی ژێر لێکۆڵینەوە بەردەوام دەکرێن بۆ ماوەیەکی کاتی دیاریکراو بەپێی پڕۆتۆکۆلی ئەزموونەکە.
پێوان: دوای ماوەی حەوانەوە، تاقیکردنەوە جیاوازەکانی ژەهراویی خانەیی (وەک MTT یان LDH یان Trypan Blue) ئەنجامدەدرێن بە مەبەستی هەڵسەنگاندنی ڕێژەی خانە زیندووەکان و خەمڵاندنی قەبارەی زیانی خانەیی.
شیکردنەوەی داتاکان: ئەنجامەکانی دەرچووی تاقیکردنەوەکان بە ئاماری شیدەکرێنەوە بۆ دیاریکردنی کاریگەری مادەی تاقیکراو لەسەر مانەوەی خانەکان، و بۆ زانینی بوون یان نەبوونی ژەهراویی خانەیی.
ئامادەکردنی ڕاپۆرت: هەموو ئەنجامە کۆتاییەکان لەناو ڕاپۆرتێکی زانستی تەواودا بەڵگەنامەدەکرێن، کە شیکردنەوەی ئاماری داتاکان و لێکدانەوەی ئەنجامەکان لەخۆدەگرێت، لەگەڵ پێشکەشکردنی دیاگرامە بیانی و خشتە ڕوونکەرەوە گونجاوەکان.