||
RT-PCR (relative and absolute) and data interpretation

کارلێکی زنجیرەیی پۆلیمیرازی پێچەوانە (RT-PCR) و شیکاری داتا

کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) یەکێکە لە وردترین ڕێگاکان بۆ شیکردنەوەی دەربڕینی جینی، کە واتا ئەوەیە کە دەتوانین دیاری بکەین کە ئایا دەربڕینی جینە دیاریکراوەکان زیاد دەبن یان کەم دەبنەوە لە ژێر مەرجە دیاریکراوەکاندا، یان بەبێ گۆڕانکاری دەمێننەوە. پێش دەرکەوتنی کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) لە کاتی ڕاستەقینەدا، ڕێگا باوەکانی زیاتر بۆ دیاریکردنی ئاستەکانی دەربڕینی جینی بریتی بوون لە: Northern blotting، RNase protection assays، و endpoint reverse transcription (RT) PCR. RT-PCR زیاتر بەکارهاتبوو بەراورد بە دوو ڕێگاکەی تر بەهۆی ئاسانی ئەنجامدانی و پێویستیی کەمتری بۆ ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)، بەڵام بەم ڕێگایەوە تەنها دەکرا ئاستەکانی دەربڕینی جینی لە کۆتایی کارلێکەکەدا ببینرێن لە ڕێگەی ئەنجامدانی electrophoresis بۆ بەرهەمی کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) لەسەر جێلی ئاگارۆز. بۆیە RT-PCR دەکرا سوودمەندتر بێت بۆ دیاریکردنی بوونی یان نەبوونی جینێکی دیاریکراو. لە ڕاستیدا، ئەم تاقیکردنەوەیە جۆرێکە لە تاقیکردنەوە جۆرییەکان یان نیوە کۆ. بۆیە بە RT-PCR ناکرێت شیکردنەوەی کۆیی بۆ دەربڕینی جینێکی دیاریکراو ئەنجام بدرێت، کە ئەمەش پێویستی بە بەکارهێنانی ڕێگایەکی تر دەخاتەڕوو کە بە تەواوی کۆیی بێت.

لە ڕاستیدا، کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) هەمان RT-PCR ـە، بەڵام بە بەکارهێنانی مادەی فلۆرۆسێنت، دووبارەبوونەوە و زیادبوونی ژمارەی کۆپیکانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) لە کاتی کارلێکەکەدا دیاری دەکرێت. لەم ڕێگایەدا، مادەکان بەکاردێن کە ئاماژە بە کاتی جێبەجێکردنی هەر سووڕێک لە کارلێکەکە دەکەن، کە ڕێگە بە شیکردنەوەی وردی کۆیی دەربڕینی جینی دەدات. لەسەر بنەمای ئەوەی باسکرا، بوونی کۆنترۆڵەکان (واتا خانەکان کە هیچ گۆڕانکارییەکی جێبەجێکراویان تێدا نییە) لە ئەنجامدانی ئەم تاقیکردنەوەیەدا پێویستە.

سوودەکانی کارلێکی RT-PCR:

  • پێوانی ژمارەی کۆپیکانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) بۆ جینەکە لە سەرەتادا و دیاریکردنی بچووکترین جیاوازی لە ئاستەکانی دەربڕین لە نێوان نموونەکاندا.

  • چاودێریکردنی زیادبوونی پێکەوەیی بەرهەمەکانی کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) لە کاتی تاقیکردنەوەکەدا.

  • پێویستی نەبوون بە electrophoresis بۆ جێلی ئاگارۆز، کە ڕێژەی گوماڵبوون لەم قۆناغەدا کەم دەکاتەوە.

مادەکانی پێویست بۆ ئەنجامدانی تاقیکردنەوەکە:

  1. کۆمەڵە دەرهێنانی total RNA

  2. کۆمەڵە دروستکردنی cDNA

  3. کۆمەڵە Master Mix بۆ RT-PCR

  4. ئامێری Thermo cycler

هەنگاوەکانی تاقیکردنەوەی RT-PCR

دەرهێنانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)

یەکەم قۆناغ لە ئەنجامدانی تاقیکردنەوەی RT-PCR دەرهێنانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)یە، کە بەپێی جۆری نموونەکە جیاوازە. بە گشتی، دەرهێنانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) بە ڕێگا جیاوازەکان ئەنجام دەدرێت:

  • ڕێگاکانی دەرهێنانی ئۆرگانی بە بەکارهێنانی مادەکانی وەکو Trizol، Qiazol، RNA STAT-60T، لەگەڵ ڕێگاکانی پشتبەستوو بە Guadinium salt.

  • جۆرە جیاوازەکانی کۆمەڵە جیاکردنەوەی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) بە بەکارهێنانی solid phase، کە لە کۆمپانیا جیاوازەکانەوە بە شێوەی بازرگانی بەردەستن.

گرنگە کە دەرهێنانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) لە هەموو نموونەکان بە شێوەیەکی یەکگرتوو ئەنجام بدرێت. ئەگەر ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)ی دەرهێنراو دەستبەجێ تاقی نەکرێتەوە، دەبێت لە فریزەر لە -20 پلەی سەدی پاراستن بکرێت بۆ ماوەی مانگێک، و بۆ کاتی درێژتر لە فریزەر لە -80 پلەی سەدی. ڕێژەی هەڵمژینی لە درێژی شەپۆلی 260/280 بۆ ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)ی دەرهێنراو دەتوانێت ئاماژە بە کوالیتی دەرهێنانەکە بکات؛ ئەگەر ئەم ڕێژەیە 1.8 بێت، ئەوا ئەمە کوالیتیی باشی دەرهێنانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) پیشان دەدات.

ئەنجامدانی لەبەرگەڕانەوەی پاشگەڕ (Reverse Transcription)

بۆ ئەنجامدانی کارلێکی پۆلیمەرێیزی زنجیرەیی (PCR) لە کاتی ڕاستەقینەدا، پێویستە cDNA لە ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)ەوە دروست بکرێت. کۆمەڵە جیاوازەکان بۆ ئەم مەبەستە لەلایەن کۆمپانیاکانەوە پەرەپێدراون، و هەموویان لەسەر هەمان بنەما کاردەکەن. هەموو ئەم کۆمەڵانە ئەنزیمی MMLV بەکاردێنن، کە ئەنزیمی reverse transcriptase ـە. لە مادە تریش کە لە بەرهەمهێنانی cDNA بەکاردێن دەتوانین ئاماژە بە random hexamer یان Oligo dT بکەین، کە وەکو مادەی سەرەتایی بۆ ئەنزیمەکە کاردەکەن. دوای زیادکردنی ئەم مادانە بە چڕیی کە کۆمپانیا دروستکەرەکە دیاری دەکات، کارلێکەکە لە ئامێری PCR لە پلەی گەرمی و کاتێکی دیاریکراودا دادەنرێت، کە ئەوانیش لەلایەن کۆمپانیا دروستکەرەکەوە دیاری دەکرێن. پێویستە کە ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) لە هەموو نموونەکان بە هەمان بڕ بۆ دروستکردنی cDNA بەکاربهێنرێت، چونکە ئەم تاقیکردنەوەیە دەبێت زیادبوون لە دەربڕینی mRNA بۆ جینێکی دیاریکراو بە هەمان بڕەکانی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) پیشان بدات.

کۆنترۆڵە ناوخۆییەکان

لە ئەنجامدانی تاقیکردنەوەی RT-PCR دا، لەگەڵ جینە ئامانجەکان بۆ دیاریکردنی ئاستەکانی دەربڕین، دەبێت جینێکی تریش وەکو جینی ماڵەوە (Housekeeping) زیاد بکرێت. ئەرکی ئەم جینە لە ڕوونکردنەوەی دروستی دروستکردنی cDNA، پاکی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)ی دەرهێنراو، دروستی ئەنجامدانی تاقیکردنەوەی PCR، هەروەها ئاساییکردنی دەربڕینی جینەکانی تردا دەبینرێتەوە. بۆیە پێویستە لە یەکەم جار (دیزاین بکرێت یان لە وتارەکانەوە وەربگیرێت) و مادە سەرەتاییەکان بۆ هەموو ئەو جینانە دروست بکرێن کە تاقی دەکرێنەوە، پێش ئەوەی هیچ کارێک بکرێت. لە هەر کارلێکی PCR دا، پێویستە ئەم مادانە بن: ئەنزیمی DNA polymerase کە پێی دەگوترێت Taq، buffer، MgCl2، dNTP، مادە سەرەتاییەکان، و لە کۆتاییدا cDNA.

کۆنترۆڵی نەرێنی

گرنگە ئاماژە بەوە بکرێت کە لە هەموو تاقیکردنەوەکاندا، کارلێکێکی زیادە بۆ هەر جین ئەنجام دەدرێت کە هەموو ئەو مادانەی تێدایە کە لە کارلێکی PCR دان، بەبێ cDNA. پێویستی ئەنجامدانی ئەم کارلێکە زیادەیە لە دڵنیابوونەوە لە نەبوونی گوماڵبوون لە نموونەکان و نەبوونی کارلێکەکانی وەکو primer dimers لە تاقیکردنەوەکەدا دەبینرێتەوە.

سەرچاوە هەڵەکان:

  1. دەرنەهێنانی RNA بە شێوەیەکی دروست

  2. نەبوونی پاکی تەواوی RNA

  3. دروست نەکردنی cDNA

  4. هەڵە لە زیادکردنی مادەکانی PCR

  5. کالیبرە نەکردنی ئامێری PCR

  6. گوماڵبوون لە هەر قۆناغێک لە کارەکە

  7. دیزاین نەکردنی مادە سەرەتاییەکانی گونجاو و تایبەت

  8. بوونی گوماڵبوون لە DNA ی خانەیی

شیکردنەوە کۆییەکان لە RT-PCR دا

دوو ڕێگای سەرەکی هەیە بۆ شیکردنەوەی کۆیی لە RT-PCR دا:

1.     ڕێگای خڕی پێوەری (بەراوردی ڕەها):

لەم ڕێگایەدا، نموونەی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) یان ترشی نیوکلەییک (DNA) بە چڕیی دیاریکراو بەکاردێت بۆ کێشانی خڕی پێوەری. چڕی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA) یان ترشی نیوکلەییک (DNA)ی پێوەری بە بەکارهێنانی spectrophotometer (260nm) دیاری دەکرێت، پاشان بە پشتبەستن بە کێشی گەردیی نموونەکە دەگۆڕدرێت بۆ ژمارەی کۆپیکان. دەکرێت پێوەرە چڕییەکان بۆ جینە ناسراوەکان بە شێوەی بازرگانی بکڕدرێن، ئەگەرچی زۆر گرانن. زنجیرەیەک لە نموونە پێوەرییەکان ئامادە دەکرێن، پاشان لەگەڵ نموونەی ئامانج لە ئامێری PCR لە کاتی ڕاستەقینەدا دادەنرێن. بە بەکارهێنانی Ct کە ئامێرەکە بۆ هەر ئاوکردنەوەیەک پێمان دەدات، خڕێک کێشراو کە X ـی ئاوکردنەوە یان ژمارەی کۆپیکانی جینەکەیە و Y ـی CT ـە. خڕی دەرچووە خڕێکی خەتییە، کە کاتێک ژمارەی نموونەی ئامانج دەخرێتە ناو خڕەکەوە، چڕی یان ژمارەی کۆپیکانی بەدەست دێت. باشترە درێژی پارچە پێوەرییەکە یەکسان بێت لەگەڵ درێژی پارچە ئامانجەکە.

2.     ڕێگای ئاستانەی ڕێژەیی (بەراوردی ڕێژەیی):

بۆ لابردنی گۆڕانکارییەکانی بڕی ترشی نیوکلەییک ڕیبۆزی (RNA)ی خراوەتە ناو کارلێکەوە و هەڵەکانی کارکردنی ئامێرەکان و کەسەکان، پێوەرە ناوخۆییەکان بەکاردێن. دەبێت ئەم پێوەرانە دەربڕینێکی جێگیریان هەبێت لە هەموو شانەکاندا، و نابێت تاقیکردنەوەکەمان دەربڕینیان بگۆڕێت بەراورد بە نموونەی کۆنترۆڵەکە. بۆ ئەم مەبەستە، جینی Beta-actin و GADPH بەکاردێن، کە بە ناوی جینەکانی Housekeeping ناسراون. دەربڕینی ئەم جینانە جێگیرە، و لە ڕێگەی بەراوردکردنی نموونەی چارەسەرکراو لەگەڵ شایەت و کۆنترۆڵی ناوخۆییەوە، دەتوانرێت زیادبوون یان کەمبوونەوەی دەربڕین ببینرێت.

ناسینەوەی فرەشێوەیی بە RT-PCR

ئەم تەکنیکە ڕێگەمان پێدەدات بڕی ناوچە فرەشێوەکانی ترشی نیوکلەییک (DNA) یان دیاریکردنی شێوازە جینییەکانی فرەشێوەیی خاڵی (SNPs) دیاری بکەین. چاودێریکردنی پڕۆسەی دووبارەبوونەوە و دیاریکردنی شێوازی جینی لە هەمان کاتدا بە بەکارهێنانی hybridization ی probe ـەکان و شیکردنەوەی خڕی تواندنەوە ڕەگەز دەکرێت. گۆرانکارییە خاڵییەکان لە ڕێگەی شیکردنەوەی خڕی تواندنەوەوە ناسراونەتەوە. پلەی گەرمیی گرنگی Tm، کە ترشی نیوکلەییک (DNA) تاک زنجیرە دەبێت، ئاماژەکەرە بۆ بوون یان نەبوونی گۆرانکاری. probe ـی تایبەت بۆ ناوچە گۆڕدراوەکە ئامادە دەکرێت، کە probe ـەکان لە پلەی گەرمیی نزمدا بە ناوچە ناتایبەتەکانەوە دەبەسترێنەوە، و لەگەڵ زیادبوونی گەرمی، probe ـەکان بە شێوەیەکی زیاتر تایبەتانە کاردەکەن. خڕی تواندنەوەی دەرچووی ئەم کارلێکە شی دەکەینەوە بۆ دیاریکردنی بوون یان نەبوونی گۆرانکارییەکە.